網膜芽細胞腫における癌抑制遺伝子の発現とEIA蛋白ーウィルス発癌モデルを用いた分子病理学的研究ー

1990 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 02670147
• 研究機関: 東京女子医科大学
• 研究代表者: 小林 槙雄 東京女子医科大学, 医学部・第一病理, 教授 (80060086)
• 研究分担者: 沢田 達男 日本大学, 医学部, 助教授 (90162544)
• キーワード: 網膜芽細胞腫 / アデノウイルス12型 / DNA解析 / Rb遺伝子 / サザンブロット法 / in situハイブリダイゼ-ション

研究概要

HEK細胞で増殖させたヒトアデノウイルス12型TW株(東京大学医科学研究所癌ウイルス研究部白木和子博士の供与)10^8PFU(感染力価)の濃縮液0.005mlをHamilton注射筒に接続した硝子毛細管により新生仔CDF系ラット(生後24時間以内)7匹の硝子体内に接種し腫瘍を誘発した結果接種後64日までに2匹の動物に腫瘍に誘発できた。本年度は実施計画の1)アデノウイルス型誘発腫瘍組織からのEIA領域DNAの発現を,ビオチン化プロ-ブを用いたサザンブロット及びin situ ハイブリダイゼイション法で検討した。サザンブロット法は、試料DNAを新鮮腫瘍組織より抽出、制限酵素(Eco RI)で切断し、アガロ-ス電気泳動によりDNA断片を分離して行った。ハイブリダイゼ-ションに用いるEIA領域DNAプロ-ブはランダムプライム法で調製し、フォトビオチン標識とした。In situハイブリダイゼ-ション法は、同一のプロ-ブを用いて小路らの方法に従い、4%PFA/PBSで潅流固定した凍結試料をプロテア-ゼで前処理の後、湿箱中で反応を行い酵素抗体法(ABC法)で呈色した。
ヒトアデノウイルス12 EIA領域cDNA断片をプロ-ブとしたin situ hybridezationでは、アデノウイルスを接種して1週間後の網膜組織において、内顆粒層の細胞中にEIAの発現が確認された。接種後、腫瘍を形成した動物及び腫瘍形成を認めなかった動物の網膜組織よりgenomic DNAを抽出した。このDNAを用いてサザンブロット法を行うと、対照としてラット血清アルブミンcDNAをプロ-ブとした場合、全ての抽出されたDNAとのhybridizeするbandが認められた。アデノウイルス12型 EIA断片をプロ-ブとした場合には腫瘍組織より抽出したDNAにおいてのみbandが認められた。又、ヒトRb遺伝子cDNA(H3ー8領域)をプロ-ブとすると、対照動物から抽出したDNAとは反応が弱いが、すべてのDNAにおいてbandが同定された。我々の実験結果からは、ウイルス誘発網膜腫瘍ではヒト網膜芽細胞腫と同様のRb遺伝子の不活性化は証明できなかった。

研究成果

• [文献書誌] T.Sawada,Y.kusumi,M.Nakamura,I.Sakurai: "Kinetic study of the neovascularization in the experimental CNS tumors of rats" Acta Pathol.Jpn.
• [文献書誌] T.Sawada,Y.Kusumi,M.Nakamura,I.Sakura: "Morphological study on newly formed micro blood vessels of the experimental CNS tumors Effects of transplanted area." Nichidai Ishi (In Japanese). 49. 943-947 (1990)
• [文献書誌] Y.Kato,H.Mathumoto,M.Kobayashi,Y.Okada,A.Kawaoi: "Genomic DNA analysis of adenovirus type 12 induced rat retinal tumor" Acta Pathol. Jpn.
• [文献書誌] 小林 槙雄,澤田 達男,加藤 陽一郎,川生 明: "アデノウイルス12型誘発ラット網膜腫瘍におけるDNA解析" 日本病理学会誌. 80. 221- (1991)