| 研究概要 |
1.ブタの脳を屠殺後1時間以内に得、そのホモジネ-トから重合脱重合法にてチュブリン、マイクロチュ-ブル関連蛋白(MAPs,Tau)を精製した。脳実質100gあたり約500mgのチュブリン、MAPs,Tauを得た。それをさらに、イオン交換クロマトグラフにかけチュブリンを分離精製した。脳実質100gあたり約50mgのチュブリンを分離精製した。純度の検定を、SDSーポリアクリルアミドゲル電気泳動と重合活性のチェックでおこなった。収量は参考文献に比べて約1/2であったがチュブリンを精製することが出来た。残りのチュブリンはイオン交換クロマトグラフに非特異的に吸着されて分離されず、改良の余地があると思われる。
2.同様に、ブタの脳をホモジナイズし、重合脱重合によりチュブリン、MAPs,Tauを除いた粗抽出液上清に1.で得られた精製チュブリンを加えた。さらにAMPーPNP,Taxolを加えてチュブリンを重合させた後、キネシンと結合させ、超遠心後のペレットにATPを加えて分離抽出した上清粗キネシン分画(S4)を得た。さらにゲル瀘過、イオン交換クロマトグラフィ-を用いてキネシン分画を分離精製した。純度の検定は、SDSーポリアクリルアミドゲル電気泳動を主体にし、チュブリンを加えたATPase活性の増強のチェックによっておこなった。脳実質100gあたり約20μgのキネシンが得られた。
3.上記2.の操作を繰り返しおこない得られた精製キネシンをマウスに免疫して単クロ-ン抗体作製を試みている。その抗体価と特異性を確認するために、キネシンをマイクロプレ-トに固層化して抗体を反応させ、酵素標識抗体の反応をマイクロプレ-トリ-ダ-で計測するELISA法を準備中である。
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