C,difficileが産生する赤血球凝集活性を欠くトキシンAの性状解析

1990 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 02670178
• 研究機関: 金沢大学
• 研究代表者: 神谷 茂 金沢大学, 医学部, 講師 (10177587)
• 研究分担者: 山川 清孝 金沢大学, 医学部, 助手 (20110629)
• キーワード: C.difficile / トキシンA / 赤血球凝集活性 / 変異型トキシン / アフィンティクロマトグラフィ- / イムノブロッティング / 腸管毒性

研究概要

Clostridium difficile培養上清をモノQカラムを用いたFPLCにより分析した結果、トキシンA(エンテロトキシン)画分の細胞毒性ピ-クと赤血球凝集(HA)活性ピ-クとが解離することがわかった。StepーwiseのNaCl溶出実験により、この解離は溶出時のNaCl濃度差に基ずくものではないことが明らかにされ、C.Difficileの培養上清中にはHA活性を欠く変異性トキシンAが存在することが示唆された。培養上清のサイログロブリンアフィニティクマトグラフィ-素通り画分(HA活性陰性)を用いてQセフアロ-スFF及びモノQーFPLCを行ない変異型トキシンAを精製した。未変性及びSDSーPAGEの結果、変異型トキシンAの分子量はHA活性をもつトキシンAと同じく未変性状態で540kDa、変性状態で240kDa(主バンド)であった。トキシンAに対するモノクロ-ナル抗体を用いたSDSーPAGE後のイムノブロッティングにより、変異型トキシンAの240kDaの主バンドはトキシンAと同様に抗体と強く反応することが明らかにされた。また還元時、160kDaのマイナ-バンドが変異型トキシンAに比べトキシンAで強く検出された。変異型トキシンAの生物活性をトキシンAのそれと比較した。変異型トキシンAはトキシンAと同程度の細胞毒性、マウス致死毒性、腸管毒性(ウサギ結紮腸管試験による)をもつことが明らかにされた。キモトリプシンを含まないトリプシン(Type XIII)を用てい酵素処理をしても、変異型トキシンAのHA活性が回復されたり、トキシンAのHA活性が消失するようなことはなかった。トキシンAのHA活性の生物学的意義は未だ明らかにされていないが、本トキシンの腸管上皮細胞への結合の際に重要な役割をなすものと考えられている。しかし今回得られた結果は、トキシンAのHA活性は腸管毒性の発現に必要でないことを示唆している。

研究成果

• [文献書誌] S.Kamiya: "Recovery of spores of Clostridium difficile altered by heat or alkali" ournal of Medical Microbiology. 29. 217-221 (1989)
• [文献書誌] S.Kamiya: "Purification and Characterisation of Clostridium diffcile toxin A by bovine thyroglobulin affinity chromatography and dissociation in denaturing conditions with or without reduction" Journal of Medical Microbiology. 30. 69-77 (1989)
• [文献書誌] S.Kamiya: "Modification of purification method for Clostridium difficile toxin A by thyroglobulin affinity chromatography and characterization of the purified toxin A" Japanese Journal of Medical Science and Biology. 42. 186-187 (1989)
• [文献書誌] S.Kamiya: "Detection of variant toxin A without haemagglutination activity of Clostridium difficile,and analysis of its biochemical and biological characteristics" Japanes Journal of Medical Science and Biology.
• [文献書誌] S.Kamiya: "Detection and characterisation of a nonーhaemagglutinating form of Clostridium difficile toxin A" Infection and Immunity.
• [文献書誌] S.Kamiya: "Purification and biological characterisation of a nonーheamagglutiーnating form of Clostridium difficile toxin A" Journal of Medical Microbiology.