リソゾ-ム酵素糖鎖リン酸化酵素の解析によるムコリピド-シスの病態解明に関する研究

1991 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 02670420
• 研究機関: 北海道大学
• 研究代表者: 賀佐 伸省 北海道大学, 医学部, 助教授 (10142712)
• 研究分担者: 藤田 充康 北海道大学, 歯学部, 講師 (10181372)
• キーワード: 糖鎖リン酸化酵素 / リソゾ-ム酵素 / ムコリピド-シス / Iーcell液

研究概要

ムコリピド-シスII型(IーceII病)とIII型で欠損、あるいは活性発現不全を示すリソゾ-ム酵素糖鎖リン酸化酵素、GlcNAcー1ーphosphotransferase(GNPT)は、正常組織(おもに肝臓)ではその発現量が低いことや不安定であること、また、活性測定に用いるリン酸化糖供与体([βー^<32>P]UDPーGlcNAc)を合成しなければならないことなどから精製が遅れ、蛋白化学的な解析は皆無であった。従って、II型やIII型の酵素学的な病態解析、あるいは本疾患における酵素の動態は不明であることから、本疾患の解析が他の代謝病と比較して最も遅れている。
本研究は規定の年度内に以下の事柄を明らかにした。
1.ラット肝より本酵素を高度(約30万倍)に精製し、それに対するポリクロ-ナル抗体を作製した(論文投稿準備中)。本抗体はしかし、ヒト肝その他のヒト組織のGNPTとは免疫学的に反応しなかった。
2.ラット肝を用いた本酵素の精製法(肝ゴルジ膜→イオン交換クロマト→UDPーガラクツロン酸セファロ-ス→アビジンセファロ-ス→ゲル濾過→ブル-セファロ-ス)をヒト肝に適用して本酵素の精製を試みたが、約1万倍の精製度(3回)に留まった。原因として、ヒト肝の新鮮標本あるいは不凍結組織を得ることが困難であることが挙げられる。凍結組織からゴルジ膜を高収率で得ることは困難であり、凍結合組織を用いた精製法を改良する必要がある。かつ、より効果的なアフィニティ-クロマトを検討する必要がある。
3.ラット繊維肉腫細胞(KMTー17,北大で樹立)では正常ラット肝に比べて20倍の高い非活性を示した。この細胞を腹水化しても高活性を維持していたので、この腹水細胞を用いてGNPTのより簡便な精製法を検討している。本方法が成功すれば、ヒト繊維肉腫細胞あるいはヌ-ドマウスで増殖させた組織に適用できる可能性がある。
GNPTはヒト白血病細胞や血清、あるいは肝癌組織で顕著に高活性を示すので、酵素の精製源として癌組織が有効である事が明らかになった。

研究成果

• [文献書誌] Y.Uehara: "Increased Nーacetylglucosamineー1ーPhosphotransferase activity in sera from patients with leukemia" Jpn,J,Cancer Res,. 82. 82-85 (1991)
• [文献書誌] M.Ohhira: "Elevated carbohydrate phosphotransferase activity in human hepatome and phosphorylation of cathepsin D" Br.J.Cancer. 63. 905-908 (1991)
• [文献書誌] S.Gasa: "Elevated serum level of glycolipid sulfotransferase in patients with hepatocellular carcinoma" Cancer Lett.59. 19-24 (1991)
• [文献書誌] 賀佐 伸省: "細胞内局在シグナルと疾患「Iーcell病」" BIOmedica. 7. 135-138 (1992)
• [文献書誌] N.Sakakibara: "Distinctive glycolipid patterns in Wilms′tumor and renal cell carcinoma" Cancer Lett.57. 187-192 (1991)
• [文献書誌] J.Tanaka: "Characterization of the subunits and sugar moiety of human placental and leukemic βーglucuronidase" Biol.Chem.HoppeーSeyler. 373. 57-62 (1992)
• [文献書誌] 賀佐 伸省: "新生化学実験講座" 東京化学同人, 4 (1992)
• [文献書誌] 賀佐 伸省: "タンパク質化学" 廣川書店, 5 (1992)