25ーヒドロキシビタミンD_3 1αー水酸化酵素の精製とその性質解明

1990 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 02670833
• 研究機関: 広島大学
• 研究代表者: 奥田 九一郎 広島大学, 歯学部, 教授 (80034156)
• 研究分担者: 大山 義彦 広島大学, 歯学部, 助手 (30169081)
• キーワード: ビタミンD_3 / 24ー水酸化酵素 / 1αー水酸化酵素 / cDNA

研究概要

25ーヒドロキシビタミンD_3は腎臓ミトコンドリアにおいて、生体のカルシウム状態に応じて時には1α位に,時には24位に水酸される。このうちビタミンD_324ー水酸化酵素については、我々はその精製法を確立した。今回は1αー水酸化酵素の精製を試みたが現在の所未だ電気泳動上単一標品を得るに至っていない。本酵素精製の因難さはその著しく低い含量と極度に失活し易いことに原因があるように思われる。従って直接法で本酵素の精製を試みることは容易なことではないと判明した。そこで別の方法として24ー水酸化酵素のcDNAを分離しそれを用いて分子生物学的アプロ-チにより本酵素のcDNAを拾いあげる方法を検討することにした。その理由は1αー水酸化酵素も24ー水酸化酵素も共に腎臓ミトコンドリアに存在すること、何れも基質として共通の25ーヒドロキシビタミンD_3に働くこと等を考慮すると両者の構造の中にはこれらを認識する共通な構造が存在する可能性も考えられる。そこで本年度は25ーヒドロキシビタミンD_324ー水酸化酵素をコ-ドするcDNAのクロ-ニングを行いその構造を解析することにした。そのために25ーヒドロキシビタミンD_324ー水酸化酵素を更に高度に精製し、得られた精製酵素を抗原として抗体を作製し、次にこの抗体をプロ-ブとしてラット腎臓cDNAライブラリ-より25ーヒドロキシビタミンD_324ー水酸化酵素をコ-ドするクロ-ンを拾いあげた。次のsangerの方法によりこのクロ-ンの全ヌクレオチド配例を決定しそれをもとにして24ー水酸化酵素の全一次構造を明らかにした。さらにこのcDNAが正しく本酵素をコ-ドしていることを確かめるためにこのcDNAを発現ベクタ-に入れ、それをcos細胞で発現した。
次のこの24ー水酸化酵素をコ-ドするcDNAをプロ-ブとしてカルシウム欠乏状態にしたラット腎より調整したcDNAライブラリ-より、1αー水酸化酵素をコ-ドするcDNAを現在探しているところである。

研究成果

• [文献書誌] Usui,E.,Noshiro,M.,Okuda,K.: "Molecular cloning of vitamin D_3 25ーhydroxylase from rat liver mitochondria" FEBS LETTERS. 260. 135-138 (1990)
• [文献書誌] Noshiro,M.,Nishimoto,M.,Okuda,K.: "Rat liver cholesterol 7αーhydroxylase" J.Biol.Chem.265. 10036-10041 (1990)
• [文献書誌] Usui,E.,Noshiro,M.,Ohyama,Y.,Okuda,K.: "Unique property of mitochondrial P450 to catalvze the two physiologically important reactions involved in both cholesterol catabolism and vitamin D activation" FEBS LETTERS. 274. 175-177 (1990)
• [文献書誌] Nishimoto,M.,Noshiro,M.,Okuda,K.: "Structual analysis of the gene encoding rat cholesterol 7αーhydroxylase,the key enzyme for bile acid biosvnthesis" J.Biol.Chem.