| 研究概要 |
Bacteroides gingivalis(ATCC 33277)の培養条件を検討した結果、寒天培地ではHK(極東)、半流動培地および液体培地ではGAM(日水)が最も発育が良好であった。したがって以後の実験には、5%ウサギ血液加ブルセラHK寒天培地、GAM半流動培地(ヘミン5μg/ml,ビタミンK10μg/ml)GAMブイヨン培地(ヘミン5μg/ml,ビタミンK10μg/ml)を用いた。コラゲナ-ゼ活性は37℃,4ー5日間嫌気培養後に集菌し、0,1MTrisーHCl緩衝波pH7,4+5mM Ca Cl_2に溶解した膜分画で最も高い酵素活性を示した。大腸菌プラスミドによるBacteroides gingivalisの遺伝子バンクの作製ならびに大腸菌のBacteroides gingivalisDNAプラスミドによる形質転換は以下のごとくに行った。つまり、Bacteroides gingivalis(ATCC 33277)をGAMブイヨン培地20mlに接種し37℃,3日間嫌気培養後、同ブイヨン培地500mlに接種し37℃,24時間嫌気培養した。ついで菌体を集菌し、通法にしたがってBacteroides gingivalisDNAを分離した。得られたBacteroides gingivalis全ゲノムDNAを3au3A1で部分的に切断し、5%ー20%ショ糖密度勾配遠心法を用いて5ー10Kbの分画を集め、クロ-ニングベクタ-Puc18BAPーBamH1サイトに組み込んだ。この組み換えプラスミドを用いてE,coli JM103株を形質転換し、発現ライブラリ-を構築した。ついで酸可溶性コラ-ゲン(Cell matrix Type Aー1)を用いてその溶解能によりコラゲナ-ゼ活性を測定し、Bacteroides gingivalisのコラゲナ-ゼ遺伝子保有株のスクス-ニングを行った。その結果4200株中21株に溶解能を認めた。更にこの21株について ^3HーCollagenを用いて2次スクリ-ニングを施行したところコラゲナ-ゼ活性を有意に示す株が認められなかった。そこでスクリ-ニング方法に問題があるものと考え、現在コラゲナ-ゼ活性を利用した方法を基本に検討中である。
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