| 研究課題/領域番号 |
02670983
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| 研究機関 | 名古屋市立大学 |
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研究代表者 |
酒井 朝也 名古屋市立大学, 薬学部, 教授 (00080169)
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| 研究分担者 |
栗本 英治 名古屋市立大学, 薬学部, 助手 (90234575)
黒田 良孝 名古屋市立大学, 薬学部, 講師 (40080204)
野原 大輔 名古屋市立大学, 薬学部, 助教授 (60080214)
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| キーワード | 球状タンパク質 / リゾチーム / タンパク質の折りたたみ / タンパク質の構造 / タンパク質の沈殿 / タンパク質の固定化 |
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| 研究概要 |
S-S結合Intactな未還元のニワトリ卵白リゾチームと全還元したLyzmを6Mグアニジン塩酸塩(Gdn-HCl)または6M尿素+6M LiClの溶液に溶したものをRefolding実験の試料とした。本年度(平成4年度)の研究実施計画に沿って実験結果を以下に記述する。
未還元Lyzmについては、CD的にも活性測定からも単に希釈で[Gdn-HCl]や[Urea+LiCl]を低くすることにより容易に100%Refoldさせることができた。また別途Urea+LiClがGdn-HClとほぼ等価なタンパク質変性剤としてUnfolding,Refoldingに使用できることが確立された。
全還元Lyzmについては、(1)[Lyzm]が低いほど良い、(2)[Urea]2MのRefolding溶液中でLoose folding状態とし、暫く保持するのが良い、(3)S-S結合再形成は(2)のfoldingより遅らせるのが良い、(4)Refolding時のIncubationは低温(4℃)で実施するのが良い、等の基本要件が確立できた。これを適切に操作することにより、[Lyzm]17.7μMで70%,1.1μMで95%のRefolding達成率を得た。
このような基本操作を駆使して全還元LyzmのRefoldingを実施する際、SubstrateとしてMicrococcus lysodeikticusのCell wallを共存させても、または合成基質であるN-acetyl-D-glucosamineを共存させても残念ながら顕著なRefolding達成率の向上は観測できなかった。また、RefoldできなかったLyzmの量が、上清液の残りとして算出した沈澱量にほぼ比例はするものの、この沈澱をRandom coil状のものから生成した部分とMisfoldしたものからのものに分割することはできなかった。
以上に加えて、3年間に亘って実施した本研究の結果をまとめた。
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