| 研究課題/領域番号 |
02680150
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| 研究種目 |
一般研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
代謝生物化学
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| 研究機関 | 山形大学 |
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研究代表者 |
吉田 匡 山形大学, 医学部, 教授 (10004673)
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| 研究分担者 |
石川 和信 山形大学, 医学部, 助手 (80222959)
佐藤 道比古 山形大学, 医学部, 助教授 (00135344)
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| 研究期間 (年度) |
1990 – 1991
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| キーワード | ヘムオキシゲナ-ゼ / 大腸菌での発現 / 部位指定変異 / 小胞体への定着機構 / ヘムポケット |
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| 研究概要 |
本研究では主としてヘムオキシゲナ-ゼの活性中心の構造解析と膜定着機構の解明を目指した。その結果、次のような興味ある知見を得た。
1.本酵素はそのC末端側に存在する疎水性ドメイン部分でミクロソ-ム膜に結合している。ミクロソ-ムをトリプシン処理するとN末端側に存在する可溶性ドメインが得られる。今回、この可溶性ドメインの精製に成功し、このドメインがヘム分解活性を保持していることを明らかにした。一般に、可溶性蛋白の方が膜蛋白よりも結晶化が容易なので、この可溶性ドメインを用いればX線回折法による構造解析がより容易になるものと期待される。
2.ラットのヘムオキシゲナ-ゼを大腸菌で発現させることに成功し、更にC末端の膜結合ドメインを欠く可溶性酵素の発現にも成功した。この系を用いて精製標品を大量に得、上記1と同様の目的の実験に供することも可能である。
3.基質であるヘムが結合する部位が本酵素の活性中心を構成していると思われる。ヘムを結合した本酵素のスペクトルはヘモグロビンのそれと酷似しているので、本酵素での活性発現にはヒスチジン残基が重要な役割を担っていることが予想される。そこでPCR法で部位指定特異変異を行い、変異酵素を上記の大腸菌発現系で発現させた。その結果、His25が本酵素活性発現に重要であることを明らかにした。現在His25の詳細な役割を検討中である。
4.本酵素の膜定着機構についてはコス細胞での発現系を確立し、この系を用いて研究を行っている。その結果、発現された本酵素はミクロソ-ムに、また、上記の可容性酵素は細胞質に局在することが知られた。現在、C末端の膜結合部のアミノ酸配列を種々変異させ、その変異が膜定着にどのような影響を及ぼすかを検討している。
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