再構成系とin vitro実験系による大腸菌蛋白質膜透過の分子機構の解析

1990 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 02680153
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 徳田 元 東京大学, 応用微生物研究所, 助教授 (40125943)
• キーワード: 蛋白質の膜透過 / 再構成実験系 / プロトン駆動力 / 大腸菌 / 海洋細菌

研究概要

反転膜小胞を用いたin vitro蛋白質膜透過系において、以下の成果が得られた。
1.分子内にジスルフィド結合を持った前駆体蛋白質は、大腸菌の膜を透過するためにプロトン駆動力が必須となることを見いだした。
2.大腸菌の蛋白質膜透過反応において、プロトン駆動力はATPに対する親和性を高める作用を持っていることを見いだした。
3.大腸菌蛋白質膜透過反応において、ATPとプロトン駆動力の役割に関してこれまでに得られた知見を総合し、モデルを提出した。
4.海洋性好塩細菌Vibrio alginolyticusの反転膜小胞において、蛋白質膜透過のin vitro実験系を構築し、大腸菌のSecA蛋白質が顕著に反応を促進することを見いだした。またこの系において、プロトン駆動力ではなく、Na^+駆動力が重要であることを見いだした。
大腸菌の蛋白質膜透過系の再構成実験系において、以下の成果が得られた。
1.細胞質膜をオクチルグルコシドで可溶化後、希釈によってオクチルグルコシドを除きリポゾ-ムに組み込み、蛋白質の膜透過系を再構成する方法を確立した。
2.SecE蛋白質を精製し、これが膜透過の必須の因子であることを明らかにした。
3.Secy蛋白質を精製し、蛋白質膜透過装置の必須因子であることを証明した。また、膜透過装置の基本単位は、SecE、Secy、SecAの3者のみで構築できることを明らかにした。

研究成果

• [文献書誌] Tokuda,H.: "In vitro protein translocation into inverted membrane vesicles prepared from Vibrio alginolyticus is stimulated by the electrochemical potential potential of Na^+ in the presence of Escherichia coll" FEBS Lett.264. 10-12 (1990)
• [文献書誌] Mizushima,S.: "In vitro translocation of bacterial secretory proteins and energy requirements." J.Bioenerg.Biomembr.22. 389-399 (1990)
• [文献書誌] Tani,K.: "Translocation of proOmpA possessing an intramolecular disulfide bridge into membrane vesicles of Escherichia coli." J.Biol.Chem.265. 17341-17347 (1990)
• [文献書誌] Shiozuka,K.: "The proton motive force lowers the level of ATP required for the in vitro translocaion of a secretory protein in Escherichia coli." J.Biol.Chem.265. 18843-18847 (1990)
• [文献書誌] Tokuda,H.: "Reconstitution of translocation activity for secretory proteins from solubilized components of Escherichia coli" Eur.J.Biochem.192. 583-589 (1990)
• [文献書誌] Tokuda,H.: "Purification of SecE and reconstitution of SecEーdependent protein translocation activity." FEBS Lett.