チトクロ-ムP450camにおける酸素ポケットの構造と機能の相関の解明ーアミノ酸置換による機能変換の解析ー

1991 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 02680224
• 研究機関: 慶応義塾大学
• 研究代表者: 島田 秀夫 慶應義塾大学, 医学部, 講師 (80095611)
• キーワード: チトクロ-ムPー450 / 一原子酸素添加酵素 / 水酸化反応 / 部位特異的変異法 / アミノ酸置換 / 酸素 / スレオニン / カンフア-

研究概要

チトクロ-ムP450(Pー450)は、プロトヘムIXをもち、その一酸化炭素化型のソ-レ-帯を450nm付近に有する一原子酸素添加酵素の総称である。この酵素の触媒作用により分子状酸素の一原子は水に還元され残り一原子は基質である有機化合物に添加(水酸化)される。この時二電子と二個のプロトンが必要である。細菌のカンフア-水酸化酵素であるP450camの活性部位には、そこに結合した分子状酸素を囲む形の構造(酸素ポケット)が存在する。ポケットを構成するアミノ酸の配列が各P450間でよく保存されていること、結晶構造が明らかにされている他のヘムタンパクにはこのような構造は認められないことから、これはP450の機能と関わる構造と推定されている。本研究はP450camの触媒作用と酸素ポケットの相関を明らかにすることを目的とする。そこでポケットを構成するアミノ酸(GlyーGlyーValー251Aspー252ThrーVal)の置換を行い、既に(1)252ThrのーOH基が水酸化反応(OーO結合の切断反応)に必須であること。(2)251Aspは酸素化型反応中間体に電子が効率よく渡るのに必須であること等を明らかにした。本年度は、以上の結果をさらに発展させ、酸素の触媒作用に必要なプロトンの供与機構に関する新しい知見等を得た。
天然型Pー450camの酸化還元電位を広いpH範囲(pH5.6ー9.0)で測定し、酸性解離基(pKa=6)が還元型酵素のヘム周辺に存在することが示唆された。またこの解離基の存在は、一酸化炭素化型のCーO伸縮振動の測定からも裏づけられた。上述した251Aspまたは252Thrを改変した酵素では、電位、伸縮振動に有意なpH依存性が見られず、この2つのアミノ酸残基が解離性基の発現に関与しているものと推定された。結晶構造を見ると252Thrはヘム鉄と相互作用できる位置にあるが、251Aspはそのような位置にない。従ってAspとThrの間に水分子を介したcharge relay系が存在しAsp残基の解離がThrのーOH基の状態を変化させると考えれば上述の結果を説明できる。一方X線構造解析を検討すると、上述した酸性の解離基を説明するcharge relay系の一つとして、252Thrから3分子の水を介して366Gluに到るsolvent channelが考えられる。そこで366GluをMetに変異されたが、この変異酵素には天然型と同じ酸性解離基が観察され、カンファ-水酸化活性も高い。従ってこの系が上述したcharge relay系とは考え難い。
以上の結果251Aspから252Thrに到るcharege relay系の存在が示唆され、最終的にThrのーOH基が、OーO結合切断に必要なプロトンの供与すると考えられる。そこでこの基と配位子との相互作用の有無を検討した。重水中、一酸化炭素型P450camのCーO伸縮振動を検討したところ、252Thrの時のみ重水の効果が観察され、252変異酵素では効果は殆ど観察されなかった。このことからThrのーOH基と結合CO間の相互作用(水素結合)が示唆された。

研究成果

• [文献書誌] Tadashi Ogishima: "Aldosterone Synthase cytochrome Pー450 expressed in the adrenals of patients with primary aldosteroism." Journal of Biological Chemistry. 266. 10731-10734 (1991)
• [文献書誌] Kuniaki Mukai: "Structural Differences in 5'ーFlanking Regions of Rat Cytochrome Pー450aldo and Pー45011β Genes." Biochem.Biophys.Res.Commun.180. 1187-1193 (1991)
• [文献書誌] Michiyo Imai: "Effects of Dietary Sodium Restriction on mRNA for Aldosterone Synthase Cytochrome Pー450 in Rat Adrenals." Journal of Biochemistry. (1992)
• [文献書誌] 島田 秀夫: "一酸化炭素化型Pー450camーカンファ-複合体の赤外CーO伸縮振動スペクトルに及ぼすアミノ酸置換の効果" 生化学. 63. 840 (1991)
• [文献書誌] 牧野 龍: "アミノ酸改変によるPー450camのプロトン供与機構の解析" 生化学. 63. 840 (1991)
• [文献書誌] 島田 秀夫: "チトクロ-ムPー450camの酸素結合部位に存在するアスパラギン酸とスレオニンのカンファ-水酸化反応における役割" 生物物理. 31. S59 (1991)
• [文献書誌] Hideo Shimada: "International Symposium on Oxygenases and Oxygen Activation" Yamada Science Foundation., (1991)
• [文献書誌] Hideo Shimada: "Dioxygen Activation and Homogenious Catalytic Oxidation." Elseevier Science PublishersB.V.,Amsterdam., (1991)