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上記課題の解明のためアフリカツメガエルの発生初期胚を材料として今年度は主に、このカエルの受精卵を用いた無細胞DNA複製系の確立とこの系でのDNA複製開始機構の解明を行った。無細胞DNA複製系は一般的に使われているラスキ-らの方法を改良して確立した。ラスキ-らの方法ではカエル受精卵の無細胞抽出液に外からDNAを加えることによりこの系の細胞周期をスタ-トさせ、外来性のDNAを中心にミニ核を形成させた後、DNA複製を開始させるというもので、この系ではDNA複製開始には開始に先だって核の形成が必須と考えられていた。しかし、本研究の方法では特に核の形成は必要でなく、前者に比べるとDNA複製系が簡素化されDNA複製の解析が行いやすくなった。この無細胞DNA複製系を用いてDNA複製活性と細胞周期との関係を調べた結果、この系では核の形成とと関係なくDNA複製活性が細胞周期のS期と一致して変動することが明らかにされた。また、この変動においてDNA複製過程の中でDNA鎖伸長活性は常に高い水準で一定に保たれているのに対してDNA複製開始の活性がS期と一致して変動することも明らかにされた。これらのことから、この無細胞DNA複製系でのDNA複製は複製の開始の過程で調節されていることが明らかにされた。そこで、本研究の目的を達成するために(1)この系でDNA複製の開始を行っている蛋白質の同定と(2)その蛋白質の活性を調節する因子の解明が今後の重要な課題としてクロ-ズアップされてきた。
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