好中球の情報伝達におけるホスホリパ-ゼDの役割とその活性化機構

1991 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 02808033
• 研究機関: 岐阜大学
• 研究代表者: 金保 安則 岐阜大学, 医学部, 助手 (00214437)
• キーワード: 好中球 / 情報伝達 / ホスポリパ-ゼD / NーformylーMetーLeuーPhe / プロテインキナ-ゼC / カルシウム / TritonXー100 / 精製

研究概要

平成3年度の研究計画に従って実験を行ない、以下の結果を得た。
[1]:ウサギ好中球をプロテインキナ-ゼC(PKC)阻害剤のスタウロスポリンやHー7で処理しておくと、NーformylーMetーLeuーPhe(fMLP)によるホスホリパ-ゼD(PLD)の活性化はさらに増大した。PKそ(活性化剤のphorbol 12ーmyristate 13ーacetate(PMA)で好中球を処理して(37℃,60分)PKCをあらかじめ活性化させておくと,fMLPによるPLD活性化はPMAの濃度依存的に抑制された。このPMAのPLD抑制効果は、NaFやイオノマイシンで刺激した場合にも認められた。以上の結果より、ウサギ好中球においては、PKCはむしろ抑制的にPLD活性を制御していると結論づけた。[2]:fMLやイオノマイシンによるPLDの活性化は、Ca^<2+>を添加した場合にのみ認められた。興味深いことに、これらの刺激剤によるPLDの活性化は、カルモジュリン(CaM)阻害剤のWー7やミオシン軽鎖キナ-ゼ(MLCK)阻害剤のMLー7により濃度依存的に抑制された。これらの結果は、Ca^<2+>がfMLPによるウサギ好中球のPLD活性化の重要な因子であり、fMLP刺激により細胞内へ流入したCa^<2+>がCaM/MLCKを活性化し、この経路を介してPLDが活性化される可能性を示唆する。今後はこの仮説を証明するため、ウサギ好中球を細胞膜と細胞質に分離し、細胞質に存在するPKCやCaM,MLCKを修飾した後、細胞膜とこれら処理細胞質を再構成し、種々の処理がPLD活性化に対してどのような影響を与えるかを検討する予定である。[3]:ラットおよびウサギ脳膜画分のPLDはTritonXー100により著明に活性化および可溶化されることをすでに確立した。そこで、TritonXー100を用いてラット脳膜画分よりPLDの精製を試みたが、可溶化されたPLDは非常に不安定で、可溶化後2ー3日で完全に消失した。今後はPLDを安定な状態で精製するため、βーOctylglucosideなどの他の界面活性剤を用いて精製を試みる予定である。

研究成果

• [文献書誌] Y.Kanaho et al.: "Activation of phospholipase D in rabbit neutrophils by fMetーLeuーPhe is mediated by a partussis toxinーsensitive GTPーbinding protein that may be distinct from a phospholipase Cーregulating protein" FEBS Lett.279. 249-252 (1991)
• [文献書誌] Y.Kanaho et al.: "Phospholipase D activation by plateletーactivating factor and leukotriene B_4,and formylーmethionyーleucylーphenylalanine in rabbit neutrophils.Phospholipase D activation is involved in enzyme release" J.Immunol.146. 3536-3541 (1991)
• [文献書誌] K.Yamada et al.: "Antigenーinduced phospholipase D activation in rat mast cells is independent of protein kinase C" Biochem.Biophys.Res.Commun.175. 159-164 (1991)
• [文献書誌] H.Kanoh et al.: "Activation and solubilization by Triton Xー100 of membraneーbound phospholipase D of rat brain" Lipids. 26. 426-430 (1991)
• [文献書誌] Y.Kanaho et al.: "Calcium,rather than protein kinase C,is the major factor to activate phospholipase D in fMLPーstimulated rabbit peritoneal neutrophils:Possible involvement of calmodulin/myosin light chain kinase pathway" J.Immunol.
• [文献書誌] H.Kanoh et al.: "Pertussis toxinーinsensitive GTPーbinding protein,rather than protein kinase C,is involved in muscarinic receptorーmediated activation of phospholipase D in PC12 cells." J.Neurochem.
• [文献書誌] 山田 浩司,ほか: "代謝 臨時増刊:シグナル伝達路とそのクロスト-ク" 中山書店, 429 (1991)
• [文献書誌] 金保 安則,ほか: "神経研究の進歩" 医学書院,
• [文献書誌] 野沢 義則,ほか: "膜学実験シリ-ズ 生体膜編" 共立出版,
• [文献書誌] 金保 安則,ほか: "生体薬科学実験講座第IV巻 生体膜の構造と機能" 廣川書店,