| 研究課題/領域番号 |
03044118
|
|---|
| 研究種目 |
国際学術研究
|
| 配分区分 | 補助金 |
|---|
| 応募区分 | 共同研究 |
|---|
| 研究機関 | 九州大学 (1993)
大分医科大学 (1991-1992) |
|---|
研究代表者 |
桑野 信彦 九州大学, 医学部, 教授 (80037431)
|
|---|
| 研究分担者 |
和田 守正 九州大学, 医学部, 助手 (20220965)
小野 眞弓 九州大学, 医学部, 講師 (80128347)
河野 公俊 大分医科大学, 医学部, 助教授 (00153479)
FOJO Antonio 国立癌研究所(米国), 主任
LONGO Dan 国立癌研究所, フレデリック支部(米国), 部長
SCHLESSINGER デーヴィト ワシントン大学, 医学部(米国), 教授
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
1991 – 1993
|
| キーワード | MDR1 / 制癌剤耐性 / DNAトポイソメラーゼ / 酵母人工染色体 / YAC / ゲノム解析 / 遺伝子増幅 / 遺伝子発現 |
|---|
| 研究概要 |
制癌剤耐性に関与する遺伝子群はがん化学療法に対する感受性を左右するだけでなく分化・発生とも密接に関連して重要な機能を有することが示され多大な注目を集めている。本研究は、このうち多剤耐性MDR1遺伝子及びエトポシド耐性関連遺伝子に焦点をしぼり、以下の事項を明かにすることを目的とする。1.遺伝子発現制御領域の単離およびゲノム構造の解析。
2.MDR1遺伝子近傍の遺伝子群の同定と共通制御の有無。
3.ヒト組織。腫瘍における発現様式。
4.ヒト腫瘍における耐性獲得の診断プローブとしての可能性の検索。
本研究で得た成果を以下に列挙する。
1.ヒトMDR1遺伝子プロモーター領域の解析。
ヒトMDR1遺伝子は2つのプロモーターによりその発現が制御されていることが報告されているが相互の役割等、詳細は不明であった。我々は下流制御領域をファージ・ゲノムライブラリーより単離し、制御ドメイン構造を明かにした。これには、制癌剤、紫外線、血清除去などに反応する制御ドメインが含まれ、MDR1遺伝子をストレス応答遺伝子群の1つとして位置づけることができた。上流プロモーターに関しては、遺伝子増幅をともなう多剤耐性細胞でのみ機能していることが示唆された。
2.ヒトMDR遺伝子群のゲノムマップの作成。
MDR遺伝子領域の構造と機能の全体的な関連を把握し、近傍の未知遺伝子の同定、共通制御の有無を明かにするための第一歩として、この領域のマッピングを試みた。上記制御領域からPCRプライマーを合成し、ワシントン大学のヒト全ゲノムおよび7番染色体特異的酵母人工染色体(YAC)ライブラリーより、YACクローンを20個単離した。エンド・クローンの単離、ヒト-ハムスター雑種パネルによる検定により約半数はキメラでなく7番染色体にマップされた。STS contentマッピング法により現在1メガベースのコンティングが構築され、またMDR1およびMDR3遺伝子を含む600kbについては、rare cutter enzymeによる物理地図を完成した。
3.YAC-ヒトゲノムライブラリーの改善。
ワシントン大学のライブラリーを含め、現在のYACライブラリーはキメラクローンが30〜50%、また不安定クローンが1%存在することが問題となっている。我々は、In gel partial fill-in法によりキメラの成因であるコライゲーションを抑え、平均500kbのライブラリーを作製する方法を開発した。さらに不安定YACクローンとして知られているヒト色盲領域を安定化させ得る変異株を単離樹立した。今後、これらの方法により、対象領域の高品質YACライブラリーを構築し、さらにコンティグ、物理地図の作成および未知遺伝子の探索を行ない、診断プローブとしての可能性を検討していく。
4.ヒトMDR遺伝子の増幅単位とその機序。
MDR1遺伝子の増幅と発現に関与するゲノム領域と構造を決定するため、MDR1と3遺伝子を含む酵母人工染色体をマウス細胞に導入し、抗癌剤ビンクリスチンに対する耐性獲得にともなう遺伝子増幅と発現の機序を検討した。
MDR1遺伝子を含む580kbの酵母人工染色体をマウスL細胞に導入した。この導入株をビンクリスチン処理することにより、MDR1遺伝子の遺伝子増幅および発現促進が認められた。しかし、マウスの内在性mdr1aの発現は見られなかった。以上、我々は酵母人工染色体を用い、MDR遺伝子領域の機能的な導入とヒトMDR1遺伝子の選択的増幅、発現をさせることに成功した。
5.エトポシド耐性関連遺伝子DNAトポイソメラーゼIIの遺伝子構造と発現。
エトポシド耐性関連遺伝子のうち、トポイソメラーゼIIやIを標的とした抗癌剤は近年その有効性から臨床応用へ多くの期待がよせられている。トポイソメラーゼの量的低下が耐性獲得の1つの原因となること、さらに高温処理により、トポイソメラーゼIIの発現が上昇することの2点を明かにした。現在、トポイソメラーゼII発現制御様式について解析を行なうためトポイソメラーゼIIプロモーター領域をファージゲノムライブラリーより単離した。現在、制御領域の一連の欠失変異体を構築し、制御ドメイン構造を明かにしつつある。
|
