| 研究課題/領域番号 |
03152001
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| 研究機関 | 北海道大学 |
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研究代表者 |
大塚 栄子 北海道大学, 薬学部, 教授 (80028836)
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| 研究分担者 |
紙谷 浩之 北海道大学, 薬学部, 教務職員 (10204629)
森岡 弘志 北海道大学, 薬学部, 助手 (20230097)
井上 英夫 北海道大学, 薬学部, 助教授 (80088856)
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| キーワード | T4エンドヌクレア-ゼV / DNAグリコシダ-ゼ / DNAエンドヌクレア-ゼ / アベ-シックDNA |
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| 研究概要 |
T4エンドヌクレア-ゼVのX線による構造解析から推定される基質結合付近の塩基性アミノ酸を変換することにより、Arg3、Arg22、Arg26がPDグリコシラ-ゼ活性に重要な残基であることがわかった。Arg3をGlnに変えると活性が完全に消失する。また、立体的にこの近傍にあるGlu23をGlnに変えた場合にもPDグリコシラ-ゼ活性は消失する。興味深いことにGlu23をAspに変換してメチレン基を一個少くした場合にもこの活性が全くなくなることがわかった。さらに、Arg3をLysに変えた場合、Arg26をLysまたはGlnに変えた場合にはKmの増大が観察されたことから、これらの残基が基質との結合に重要であることが推定される。チミンダイマ-を一個含むオリゴデオキシリボヌクレオチドを合成し、相補鎖と合わせて二本鎖を形成させ基質とした後、これらの変異体蛋白を加えて、CDスペクトルの変化を調べたところ、Glu23をGlnに変えた変異体は基質の高次構造に大きな変化を与えることがわかった。この変異体はチミンダイマ-を含まない二本鎖14merのCDスペクトルには変化を与えないことから、チミンダイマ-DNAに対する特異的結合能を有するものと思われる。つまりこの変異体は基質と結合するが触媒活性のない蛋白であり、基質との共結晶化に適したものである。
次に塩基部を持たないアベ-シックサイトを一箇所含むデオキシリボヌクレオチドを合成し、変異体の二段階目のAPエンドヌクレア-ゼ活性を調べた。ほとんどの変異体は大量に用いたときには鎖を切断するがGlu23をGlnに変えたものは全く活性を示さなかった。Glu23をAspに変えると一段階目の反応は全く進行しないがアベ-シックサイトがあると、わずかにβー脱離を起こして鎖を切断することがわかった。この時に至適pHがわずかに酸性側となることを見出した。
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