受容体型チロシンキナ-ゼを介する情報伝達機構

1991 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 03152085
• 研究機関: 神戸大学
• 研究代表者: 春日 雅人 神戸大学, 医学部, 教授 (50161047)
• 研究分担者: 門脇 孝 東京大学, 医学部附属病院, 助手 (30185889) ; 横野 浩一 神戸大学, 医学部附属病院, 助手 (50144580)
• キーワード: PIー3キナ-ゼ / GAP / IRSーI / MAPキナ-ゼ

研究概要

我々はインスリン受容体cDNAならびにEGF受容体cDNAをsiteーdirected mutagenesisの手法により改変し、合計10種以上の変異受容体のcDNAを作製した。これらのcDNAをChinese hamster ovary(CHO)細胞に発現させることに成功した。現在、これらのCHO細胞を用いて変異受容体の機能について解析中である。各種の受容体型チロシンキナ-ゼの細胞内基質蛋白のひとつと考えられているphosphatidyl inositol(PI)ー3キナ-ゼの85Kサブユニットを大腸菌に発現させ、これを抗原としてモノクロナル抗体を作製した。その結果3種類のモノクロナル抗体を得ることができ、85Kサブユニット各部分を大腸菌に発現させた蛋白との反応からそのエピト-プ部位を同定することができた。さらにこれらのモノクロナル抗体を用いて、この抗体がInsulin Receptor SubstrateーI(IRSーI)ならびにGTPase Activating protein(GAP)を免疫沈降する可能性が示唆された。すなわち、細胞をインスリンで刺激するとIRSーIがチロシン燐酸化され、この部分が85KやGAPのSHー2ドメインで認識される可能性が示唆された。さらに,PIー3キナ-ゼの110Kサブユニットと85Kサブユニットの結合部位も上記の大腸菌に発現した85Kサブユニットのフラグメントを用いて同定された。各種の受容体型チロシンキナ-ゼの細胞内基質蛋白がひとつと考えられているMAPキナ-ゼについても抗体を作製し、その変異体を培養細胞に発現し、情報伝達機構における役割を検討中である。また85Kサブユニットについても、その変異体を作製し培養細胞中に発現して、その情報伝達機構における役割を検討中である。また、IRSーIに対するモノクロナル抗体も作製予定である。

研究成果

• [文献書誌] Tobe,K.,Kadowaki,T.,Tamemoto,H.,Ueki,K.,Hara,K.,Koshio,O.,Momomura,K.,Gotoh,Y.,Nishida,E.,Akanuma,Y.,Yazaki,Y.,Kasuga,M.: "Insulin and 12-O-teradecanorylphobol 13-acetate(TPA)activation of two immunologically distinct MBP/MAP2 kinases viade hovo phosphorylation of threonine and tyrosine residues." J.Biol.Chem.266. 24793-24803 (1991)
• [文献書誌] Yonezawa,K.,Yokono,K.,Shii,K.,Ogawa,W.,Ando,A.,Hara,K.,Baba,S.,Kaburagi,Y.,Yamamoto-Honda,R.,Momomura,K.,Kadowaki,T.,Kasuga,M.: "In Vitro association of phasphatidylinasitol 3-kinase activity with the activated insulin receptor tyrosine kinase." J.Biol.Chem.267. 440-446 (1992)