筋収縮中のミオシンの分子運動の蛍光標識および蛍光抗体標識による検出と解析

1991 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 03223212
• 研究機関: 長崎大学
• 研究代表者: 宮西 隆幸 長崎大学, 医学部, 助手 (50157666)
• 研究分担者: 松田 源治 長崎大学, 医学部, 教授 (50039476)
• キーワード: ミオシン / 筋収縮 / すべり / 蛍光偏光 / 蛍光二色性 / トリデシルリゾルミン酸 / 画像解析

研究概要

ミオシン頭部(S1)重鎖のSHI基をFDNB(フルオロジニトロベンゼン)で保護しSH2基にメレイミドテトタメチルロ-ダミンを導入したのちDTTでSH1基の保護をはずした。アクチン結合能、ATPase活性はほぼ保たれていた。単一グリセリン筋線維をスライドグラス上におきプラスチックテ-プで固定し蛍光Sー1を硬直溶液中で導入し、余剰のSー1を洗浄した。蛍光顕微鏡装置下で水銀ランプ光源に偏光フィルタ-、干渉フィルタ-の順に置き偏光光線とし、対物レンズを通して筋線維に照射し蛍光Sー1より放射される蛍光像を再び対物レンズを通してカメラのCCD素子上によって結像させ画像解析装置IBASに伝送し記録解析した。励起光線の短時間の照射では殆んど蛍光強度は減少しなかった。筋線維の長軸と同じ方向(0度)と直交(90度)の2つの方向の励起光線で画像記録したところ、90度は暗く0度は明るかった。その比は約2であった。この蛍光二色性より色素の配向を計算すると筋線維長軸に対して43度であり、Miyanishi&Borejdo(1989)と良く一致した。
S1重鎖のSH1基にテトラメチルロ-ダミンヨ-ドアセトアミドを導入した場合も同様の手段で蛍光二色性が検出された。この標品に前年度に合成したATPase阻害剤トリデシルリゾルシン酸(TRA)を加えたがその二色性の程度は変わらなかった。トリプシンによるS1重鎖の部分切断によってもその値は変化しなかった。EDCでS1を筋線維に架橋した場合でもほぼ同様で、ADP、AMPPNPの添加に伴って二色性は変化した。ADP添加時の二色性とADPーVi添加時のそれとは区別できなかった。ATPを加えた場合の二色性はランダムに配向しているとした場合の解と区別できなかった。TRA存在下でもATPを添加した場合は同様にランダムに配向しているとする解と一致した。

研究成果

• [文献書誌] Miyanishi T.,Watanabe M.,Matsuda G.: "Myosin ATPase inhibitor and its effect on the conformation of myosin head" Biophys.J.59. 228a (1991)
• [文献書誌] Maita,T.,Miyanishi,T.,Matszono,K.,Tanioka,Y.,Matsuda,G.: "The primary structure of kkeletal muscle myosin heavy chain: III.sequence of the 22 kDa fragment and the alignment of the 23 kDa,50kDa,and 22 kDa fragments." J.Biochem.110. 68-74 (1991)
• [文献書誌] Maita,T.,Yajima,E.,Nagata,S.,Miyanishi,T.,Nakayama,S.,Matsuda,G.: "The primary structure of skeletal muscle myosin heavy chain: IV.Sequence of the rod and the complete 1,938ーresidue amino acid sequence of the heavy chain." J.Biochem.110. 75-87 (1991)