1991 年度実績報告書

蛍光標識少糖による蛋白質の糖鎖構造認識の解析

研究課題

研究課題/領域番号	03236226
研究機関	大阪大学
研究代表者	長谷純宏大阪大学, 理学部, 教授 (80028232)
キーワード	蛍光標識 / マンノシダ-ゼ / 酵素 / 輸卵管 / コバルト / HPLC / 逆相 / 基質特異性
研究概要	水解酵素やレクチンの分子認識を精度良く解析するには、種々の天然に存在する糖鎖又はそれに類似した複雑な構造の糖鎖を出来るだけ多種類取り揃える必要があり、酵素の場合得られた生成物を精度良く解析する必要がある。この様な蛋白質と糖鎖の結合特異性を解析するためには高感度な解析方法が要求される。ピリジルアミノ(PA-)糖鎖は、分子サイズで分かれるHPLC(サイズフラクショネ-ション)と糖鎖構造で分かれるHPLC(逆相)の二種のカラムを用いる事により、非常に複雑なPA-糖鎖でも微量で分離精製出来る事が今までに明らかとなった。このような構造解析システムは上記目的に適していると思われる。このためウズラの輸卵管をホモジナイザ-を用いてすりつぶし30,000xg上澄を粗酵素標品とし、粗酵素標品中にある、pnitrophenyl αーmannopyranoside等の簡単な構造の基質のみでは検出されない、高度の基質特異性を持ったコバルト依在性αーマンノシダ-ゼの検索を行い分離精製した。このための酵素活性の測定は前年度調製したMan_9GlcNAc_2ーPAやMan_5GlcNAc_2ーPAを基質として用い、酵素反応後、生成物をサイズフラクショネ-ションHPLCを用い蛍光検出器を用いて定量を行った。ここで検出されたαーマンノシダ-ゼについてMan_9GlcNAc_2ーPA〜Man_1GlcNAc_2ーPA等の出来るだけ種々の基質を用い、酵素消化物をサイズフラクショネ-ションHPLCと逆相HPLCで分離解析し、その基質特異性を明らかにした所、Man_9GlcNAcを水解してMan_5GlcNacにする、新しい酵素であることが分った。ニワトリ輸卵管よりウズラと同様な酵素を各種クロマトグラフィ-を用い精製し単一な蛋白質とし、酵素の基質特異性の解析を行なう予定である。

研究成果
(8件)

すべてその他

すべて文献書誌 (8件)

[文献書誌] H.Oku: "Studies on the Substrate Specificity of Neutral αーMannosidase Purified from Japanese Quail Oviduct by Using Sugar Chains from Glycoproteins" J.Biochem.110. 982-989 (1991)
[文献書誌] H.Oku: "Purification and Characterization of Neutral αーMannosidase That is Activated by Co^<2+> from Japanese Quail Oviduct" J.Biochem.110. 29-34 (1991)
[文献書誌] K.Omichi: "Studies on the Active Site of Human αーAmylase:Examination of the Third Subsite S3' of the AglyconeーBinding Site by Control of Substrate Binding Mode" J.Biochem.111. 4-7 (1992)
[文献書誌] T.Mega: "Determination of LectinーSugar Binding Constants by Microequilibrium Dialysis Coupled with High Performance Liquid Chromatography" J.Biochem.109. 600-603 (1991)
[文献書誌] T.Mega: "Characterization of CarbohydrateーBinding Specificity of Concanavalin A by Competitive Binding of Pyridylamino Sugar Chains" J.Biochem.111. 396-400 (1992)
[文献書誌] H.Watzlawick: "The Effect of the Carbohydrate Moiety upon the Size and Conformation of Human Plasma Galactoglycoprotein as Judged by Electron Microscopy and Circular Dichroism" Biochem.J.277. 753-758 (1991)
[文献書誌] 長谷純宏: "複合糖質の糖鎖研究における新しい方法論とその展望ーピリジルアミノ化の役割ー" 生化学63, 11 (1991)
[文献書誌] 長谷純宏: "糖蛋白質の糖鎖構造解析へのNMRの応用" ファルマシア, 3 (1991)

1991 年度 実績報告書

蛍光標識少糖による蛋白質の糖鎖構造認識の解析

研究代表者

長谷 純宏 大阪大学, 理学部, 教授 (80028232)

研究成果

[文献書誌] H.Oku: "Studies on the Substrate Specificity of Neutral αーMannosidase Purified from Japanese Quail Oviduct by Using Sugar Chains from Glycoproteins" J.Biochem.110. 982-989 (1991)

[文献書誌] H.Oku: "Purification and Characterization of Neutral αーMannosidase That is Activated by Co^<2+> from Japanese Quail Oviduct" J.Biochem.110. 29-34 (1991)

[文献書誌] K.Omichi: "Studies on the Active Site of Human αーAmylase:Examination of the Third Subsite S3' of the AglyconeーBinding Site by Control of Substrate Binding Mode" J.Biochem.111. 4-7 (1992)

[文献書誌] T.Mega: "Determination of LectinーSugar Binding Constants by Microequilibrium Dialysis Coupled with High Performance Liquid Chromatography" J.Biochem.109. 600-603 (1991)

[文献書誌] T.Mega: "Characterization of CarbohydrateーBinding Specificity of Concanavalin A by Competitive Binding of Pyridylamino Sugar Chains" J.Biochem.111. 396-400 (1992)

[文献書誌] H.Watzlawick: "The Effect of the Carbohydrate Moiety upon the Size and Conformation of Human Plasma Galactoglycoprotein as Judged by Electron Microscopy and Circular Dichroism" Biochem.J.277. 753-758 (1991)

[文献書誌] 長谷 純宏: "複合糖質の糖鎖研究における新しい方法論とその展望ーピリジルアミノ化の役割ー" 生化学63, 11 (1991)

[文献書誌] 長谷 純宏: "糖蛋白質の糖鎖構造解析へのNMRの応用" ファルマシア, 3 (1991)

1991 年度実績報告書

長谷純宏大阪大学, 理学部, 教授 (80028232)

[文献書誌] 長谷純宏: "複合糖質の糖鎖研究における新しい方法論とその展望ーピリジルアミノ化の役割ー" 生化学63, 11 (1991)

[文献書誌] 長谷純宏: "糖蛋白質の糖鎖構造解析へのNMRの応用" ファルマシア, 3 (1991)