|
本研究では我々が開発した高精度同調培養法を用いてS期の最初に機能している複製開始領域を同定することを目指している。ラット培養細胞(NRK)を、複製開始時に同調し、ブロモデオキシウリジンで複製開始部位を含む新生DNA鎖を密度標識した。塩酸グアニジンを用いた改良した方法で複製中間体の構造を保持したDNAを抽出精製し、複製した領域の両端にある複製フォ-クの単鎖部分をマングビ-ン・ヌクレア-ゼで切り、5回の平衡密度勾配遠心法でHL鎖として分離精製した。これをさらに制限酵素で切断して、ミニFプラスミド・ベクタ-(シングル・コピ-・ベクタ-)とメチル化DNAも効率よくクロ-ニングできるホスト細胞(DH10B)を用いてクロ-ン化した。S期の最初に複製している領域に由来していることを確認するために、ヒドロキシウレア単独法および、ヒドロキシウレアとアフィディコリンの併用法で同調化した細胞を密度標識し、HL鎖を分画しそれと、クロ-ン化DNA断片のユニ-クな配列部分をプロ-ブしたサザン・ハイブリダイゼ-ションで調べた。S期の最初に複製開始している領域の近傍に由来することが確認できたクロ-ンを5個得た。これらについて長いDNA領域を得るために、λーdashで作製したジェノミック・ライブラリ-について、約5百万個のプラ-クをスクリ-ニングしたが得られなかった。そこでミニFプラスミド・ベクタ-、連結のためのP4コスサイト、DH10Bホスト細胞を用いて、S期の始め2時間までに複製したDNAのジェノミック・ライブラリ-を作製した。これからは、数10Kbpのクロ-ンを効率よく得られ、それらの制限酵素地図を作製した。今後、そのDNA上の数カ所のユニ-クな配列部分をプロ-ブに用いて、同調化した細胞の新生鎖の蓄積領域を定量解析することにより、その複製開始領域を同定する予定である。
|
