| 研究課題/領域番号 |
03404027
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| 研究機関 | 大阪府立公衆衛生研究所 |
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研究代表者 |
魚住 光郎 大阪府立公衆衛生研究所, 副所長 (50028495)
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| 研究分担者 |
前倉 俊治 近畿大学医学部, 第二病理学教室, 助手 (20221575)
東 恵美子 大阪府立公衆衛生研究所, 微生物課, 研究員 (60250338)
勝川 千尋 大阪府立公衆衛生研究所, 微生物課, 主任研究員 (20183725)
牧野 正直 大阪府立公衆衛生研究所, 微生物課, 微生物課長 (00116097)
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| キーワード | 窒素酸化物曝露 / 気管洗浄液 / ビオチン化レクチン / コンAアガロース / インゲンマメレクチンE4 |
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| 研究概要 |
動物実験と疫学調査に共通する生体影響指標を確立する目的で、本年度も引き続き窒素酸化物曝露ラットの気管洗浄液中の曝露特異的蛋白質の精製を試みた。
これまでに窒素酸化物曝露ラットの気管洗浄液中の蛋白質を一次元および二次元ゲル電気泳動により分析し、窒素酸化物曝露にともなって増加する複数の蛋白質の存在を明らかにした。その中で分子量48キロダルトン、等電点約4.0の糖蛋白質に焦点を合わせてその精製を試みた。
ロトフォーを用いて等電点による気管洗浄液中の蛋白質の分画を試みたがきれいな分離はできなかった。つぎに、目的蛋白質が糖蛋白質であることが予想されたので、ビオチン化レクチンをプローブとして目的蛋白質に反応するレクチンの検索を行った結果、コンカナバリンA、インゲンマメレクチンE4、およびヒママメレクチンIが特異的に目的蛋白質に結合することが判明した。そこで、コンカナバリンAをアガロースビーズに固定したカラムを用いて精製を試みた。予備実験として窒素酸化物曝露ラット気管洗浄液をこのカラムに重層し、よく洗浄した後、0.2モルのメチルalpha-Dグルコシドにより溶出したところ、溶出画分に目的蛋白質と同一の分子量を持つ蛋白質を検出することができた。しかし、この画分にも目的蛋白質以外の蛋白質が混入していた。これはレクチルブロッティングの結果と良く一致していた。目的蛋白質をコンカナバリンA結合画分よりさらに精製する目的で、インゲンマメレクチンE4をアガロースビーズに固定したものをカラムに充填したものを用いた。予備実験として少量のコンカナバリンA結合画分をこのカラムに重層し、よく洗浄した後、0.2モルのほう酸カリウムにより溶出したところ、少量の蛋白質が溶出された。
今後スケールアップして同様な実験を行い、目的蛋白質が精製できているか確認して行く。
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