酵素サイクリング及びカスケード反応を用いる増幅高感度化学発売測定システム開発

1992 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 03452279
• 研究機関: 昭和大学
• 研究代表者: 辻 章夫 昭和大学, 薬学部, 教授 (80053784)
• 研究分担者: 前田 昌子 昭和大学, 薬学部, 助教授 (00053869)
• キーワード: Chemiluminescence / Dihydroxyacetone / Lucigenin / Alkaline phosphatase / Enzyme immunoassay / NADP^+ / hCG / CCK-8

研究概要

環元性物質によるルシゲニンの化学発光反応を検討し、アルカリ性ホスファターゼ(ALP)活性測定法を開発した。 基質としてガラクトース1-リン酸、グルコース-1-リン酸、フルクトース-1、6-二リン酸、アスコルビン酸-2-リン酸、グリセリン及びNADP^+を用い、種々検討した。 これらのシステムのうちNADP^+を基質とし、ジヒドロキシアセトンを生成させ、ルウシゲニンにより発光させる方法が最も高感度であった。 反応機構を示す。
ALPの検出限界は1.25×10^<-19>mol/assayであった。 前年度に開発した酵素サイクリング法より感度は低いが、操作は簡単であり、測定時間は1時間であり迅速性に優れていた。
本法を用いる化学発光酵素免疫測定法を開発した。 消化管ホルモンのCCK-8測定法の検出限界は0.2pg/assay(1.7×10^<-16>mol/assay)で、RIAより約7倍高感度であった。 RIA法との相関も良好であった。また、hCG測定法の検出限界は0.005mIU/assayで従来報告されている他のイムノアッセイ法に比べ最も高感度であった。 日常分析に用いられている時間分解蛍光イムノアッセイ法との相関は良好であり、その方法では測定不能の低濃度の検体(血液、尿)がすべて測定できた。

研究成果

• [文献書誌] M.Kitamura,M.Maeda,A.Tshuji: "Sensitive chemiluminescence assay of NADH using enzyme cycling and its application." BUNSEKI KAGAKU. 40. 537-542 (1991)
• [文献書誌] M.Maeda,A.Tsuji,et al.: "Chemiluminescent assay of alkaline phosphatase asusing ascorbic acid-2-06phosphate as substrate and its application to chemiluminescent enzyme immunoassays" J.Biolumi & Chemilumi.4. 119-122 (1991)
• [文献書誌] A.Tsuji,M.Maeda,H.Arakawa: "Chemiluminescent assay of Co-factors" J.Biolumi. & Chemilumi.4. 454-462 (1991)
• [文献書誌] M.Maeda,A.Tsuji: "Chemiluminescent assay of β-D-galactosidase and its application to competitive immunoassay for 17 ーhydroxy progesterone and thyroxine," Anal.Chim.Acta. 266. 213-217 (1991)
• [文献書誌] H.Arakawa,M.Maeda,A.Tsuji: "Chemiluminescent assay of various enzymes using indoxyl derivatives as substrate and its applicationstto enzyme immunoassay and DNA probe assay." Anal.Biochem.199. 238-242 (1991)
• [文献書誌] H.Arakawa,M.Maeda,A.Tsuji: "Bioluminescent homogeneous enzyme binding assay for biotin using luciferase as label" Anal.Letters. 25. 1055-1063 (1992)
• [文献書誌] 辻 章夫,菅野 剛史: "化学発光イムノアッセイ" ライフ・サイエンス, 147 (1992)