| 研究概要 |
Bacillus pumilusの生産するキシラナ-ゼは分子量21,000の単純蛋白質であり、クロ-ン化された遺伝子(xynA)の塩基配列からそのアミノ酸の一次配列、およびX線結晶解析の結果から、その立体構造がすでに明らかにされているので、蛋白質工学の素材として構造と機能の相関および、アミノ酸置換による機能変化を解析して、個々のアミノ酸残基の機能への貢献を評価するのに適している。
今年度は蛋白質工学的手法によりi)耐熱性増加ii)基質特異性の変化(とくにβーキシロシダ-ゼ活性を保有する)した変異酵素の取得を目標とした。xynA遺伝子をファ-ジM13mp18に挿入し、化学処理によつて人工変異を起こさせ、2本鎖にした和、xynA領域を切り出し、ベクタ-に挿入し、E.Cobに導入した。得られた形質転換体25,000株のうちでβーガラクトシダ-ゼ活性を検出できるものは存在しなかつたが、耐熱性の増加した株は得られた。これらの変異酵素の塩基配列を決定した結果、アミノ酸置換は主として最外部のβーシ-ト構造をとつている部分に起つており、キシラナ-ゼの熱不活性化は、この部分の変性が引き金となつていると推定された。
Aspergillus aculatusの分子量23,000のF1ーCMCaseのXー線結晶解析により、立体構造を決定した結果、キシラナ-ゼと非常に類似した構造をとつており、一次配列の相同性が認められないにもか丶わらず三次構造は殆んど同一であつた。この結果はキシラナ-ゼで得られた構造機能相関は広い範囲の酵素に適用できることを示している。
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