タンパク質工学を利用したタンパク質折りたたみの速度論的解析

1991 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 03453170
• 研究機関: 北海道大学
• 研究代表者: 桑島 邦博 北海道大学, 理学部, 助手 (70091444)
• キーワード: タンパク質フォ-ルディング / 部位特異的変異 / ヌクレア-ゼ / 反応速度論 / プロリン異性化反応 / タンパク質の構造形成

研究概要

本研究では、大腸菌プラスミド中にクロ-ン化された黄色ブドウ球菌ヌクレア-ゼをモデルとして、タンパク質構造形成の機構を明らかとする。そのため、ヌクレア-ゼの様々の部位特異的変異体を作製し、それらの巻き戻り反応を速度論的に解析する。これらの目的を達成するため、本年度は、以下の2点に焦点を絞り研究を行った。(1)ヌクレア-ゼのプロリン変異体の作製とそれらの巻き戻りの速度過程。(2)米国Johns Hopkins大学のShortle博士より提供されたヌクレア-ゼのクラスI変異体とクラスII変異体の巻き戻りの速度過程。
ヌクレア-ゼの巻き戻り反応の速度過程は、プロリンペプチド結合のシス-トランス異性化反応と連結しており、複雑である。既に、昨年度までの科学研究費一般研究(C)の成果により、Pro117Glyの変異は、巻き戻りとアンフォ-ルディングの両反応を単純化することがわかったが、巻き戻り反応には依然3つの速度過程が含まれており、少なくとも更に2個のプロリン残基が関与していると考えられる。更に単純化された巻き戻り反応系を確立するため、プメリンの二重変異体(Pro117Gly+Pro56Ala)を作製した。変異体の作製には、PCR法を用いた。PCRの実験条件などをいろいろ検討し、現在、変異遺伝子の作製を完了したところである。
ヌクレア-ゼのアミノ酸置換は、Molten Globule中間体を安定化する変異(クラスI変異)と不安定化する変異(クラスII変異)の2種に大別されることが、Shortle博士らにより明らかとされている。代表的なクラスII変異体であるAla69Thrヌクレア-ゼを抽出精製し、その巻き戻り反応を野生型のものと比較した。その結果、変異は巻き戻り反応速度を著しく低下させることがわかった。

研究成果

• [文献書誌] Kuwajima,K.,Okayama,Yamamoto,K.,Ishihara,T.,& Sugai,S.: "The Pro117 to Glycine Mutation of Staphylococcal Nuclease Simplifies the UnfoldingーFolding Kinetics" FEBS Letters. 290. 135-138 (1991)
• [文献書誌] Kuwajima,K.,Garvey,E.P.,Finn,B.E.,Matthews,C.R.,Sugai: "Transient Intermediates in the Folding of Dihydrofolate Reductase as Detected by Far Ultraviolet Circular Dichroism Spectroscopy" Biochemistry. 30. 7693-7703 (1991)
• [文献書誌] Sugawara,T.,Kuwajima K.,& Sugai,S.: "Folding of Staphylococcal Nuclease A Studied by Equilibrium and Kinetic Circular Dichroism Spectra" Biochemistry. 30. 2698-2706 (1991)
• [文献書誌] Permyakov,E.A.,Grishchenko,V.M. et al.: "Calciumーregulated Interaction of Human αーLactalbumin with Bee Venom Melittin" Biophysical Chemistry. 39. 111-117 (1991)