| 研究課題/領域番号 |
03454052
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| 研究種目 |
一般研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
植物保護
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| 研究機関 | 東北大学 |
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研究代表者 |
羽柴 輝良 東北大学, 農学部, 助教授 (20189476)
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| 研究分担者 |
柄澤 明 東北大学, 農学部, 助手 (90204651)
高橋 英樹 東北大学, 農学部, 助手 (20197164)
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| 研究期間 (年度) |
1991 – 1993
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| キーワード | pRS64のORF / 新規タンパク質 / pRS64と相同性を持つRNA / プラスミドの転写物 / プラスミドからの翻訳産物 / 28kDaタンパク質 / アミノ酸残基の決定 |
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| 研究概要 |
1.ヘアピン・ループ線状プラスミドDNAの塩基配列を決定し、pRS64-1、-2、-3の間には約80%の相同性があった。これらの塩基配列に対してORF解析の結果、0.4kb前後の短いORFがいくつか認められた。さらに、本プラスミドを保持するRI-64菌株から、プラスミド由来と思われる約0.5kbのRNAバンドが検出された。
RI-64菌株の全RNAの分析から、poly(A)^-RNAに対して先の約0.5kbのバンドからハイブリダイズした。この結果から、本プラスミドと相同性のあるRNAは一本鎖のpoly(A)^-RNAであることが明らかになった。
2.全RNAをショ糖密度勾配遠心によって分画し、ライブラリー作製後プラスミド由来のクローンBE-3をプローブとしてスクリーニングし、cDNAを得た。cDNAクローンの塩基配列とプラスミド(pRS64)の塩基配列を比較したところ、pRS64-1と約100%の相同性が認められた。このことからpRS64相同性を持つpoly(A)^-RNAは、pRS64-1の転写物であることが示唆された。タンパク質をコードしている領域は、ORF1-1にあたり、68アミノ酸残基からなり、全く新しい新規タンパク質であった。
3.大腸菌で大量に発現させた新規タンパク質に対する特異抗体を作製し、菌体中から抽出した粗タンパク質をSDS-PAGE後ウエスタンブロット解析をした結果、約14kDaと28kDaのバンドが特異的に反応した。さらに、二次元電気泳動後ウエスタンブロット解析の結果28kDaの2つのスポットと特異的に反応した。このことから本タンパク質はプラスミドから翻訳されていることが示唆され、N末端に未知の疎水性アミノ酸の配列を認めた。
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