光励起過程において引き起こされる急激なcGMP代謝酵素活性反動の二・三次元解析

1991 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 03454118
• 研究機関: 自治医科大学
• 研究代表者: 齋藤 多久馬 自治医科大学, 医学部, 教授 (40090419)
• 研究分担者: 埴原 恒彦 自治医科大学, 医学部, 助手 (00180919) ; 山門 誠 自治医科大学, 医学部, 助教授 (80010114)
• キーワード: 網膜 / 視細胞 / Phosphodiesterase / 急速凍結 / 酵素組織化学 / 電子顕微鏡

研究概要

本年は従来より用いられてきたPhosphodiesterase活性検出の組織化学的方法では、反応液に含まれる蛇毒により組織破壊が引き起こされ、研究対象である網膜では剥離が生じてしまう他、微細構造の破壊も甚だしく問題となっていた。組織破壊の原因が蛇毒に有るのであるから、一部には、蛇毒を除いた反応液で反応を行っても、内在性5'ーnucleotidaseが視細胞外節には存在しているので。検出上問題はないとする乱暴な主張まで現れていたが、これでは最終反応の局在の場は、組織化学の第2階を司る内在性酵素の局在に依存してしまい、第1段階の目的とするphosphodiesteraseの超微局在を証明するには ほど遠いと言わねばならない。そこで、蛇毒を精製5'ーnucleotidaseに変え、比較検討を重ねた結果、添加5'ーnucleotidaseは80単位以上が要求される事を明らかにし、併せてこれら添加酵素の組織細胞への浸透を凍結とDMSO添加により助ける組織破壊のない細胞化学的方法を確立することが出来た。
この新しい酵素細胞化学的phosphodiesterase検出法を用いた活性局在は、たまたま組識破壊を伴わない組織細胞から得られた結果同様、グルタルアルデヒド浸漬固定を用いた場合は、円板膜内腔に陽性となり、急速凍結置換固定を用いると円板膜に隣接する細胞質に陽性となる事が示された。
Phosphodiesteraseの他に、cGMP代謝酵素であるGTPase,guanylate cyclaseも円板膜の細胞質側に陽性となることが急速凍結置換固定を細織細胞化学に導入して証明されたが、これら一連の光励起過程の急激な代謝変動を司る現象が円板膜の上でどの様な分子構築により保証されているのかを明らかにすべく、凍結割断法を用いて解析を開始した所である。

研究成果

• [文献書誌] Saito,T.: "Ultfacytochemistry of enzymes in cell biology of the retina." J.Electron Microsc.40. 312-318 (1991)
• [文献書誌] Saito,T.&T.Takizawa: "The identification of an active enzyme site by raid freeze substitution enzyme histochemistry on rat retina." Acta Histochem.Cytochem.24. 121-132 (1991)
• [文献書誌] 齊藤 多久馬: "ライソゾ-ム変動からみた網膜色素上皮細胞の日周リズム" 生体の科学. 42. 571-578 (1991)
• [文献書誌] Takizawa,T.& Saito,T.: "Improved cytochemical method for cyclic 3',5'ーnucleotide phosphodiesterase in rod outer segments." Acta Histochem.Cytochem.(1992)
• [文献書誌] Saito,T.,Sano,M.,Keino,H.,Akahoshi,T.& Takizawa,T.: "Lead citrate method of guanylate cyclase and its application to tissue receiving rapid freeze substitutio fixation." Acta Histochem.Cytochem.(1992)
• [文献書誌] Ishibashi,T.,Kanazawa,K.& Saito,T.: "Ultracytochemical study of glucoseー6ーphosphate dehydrogenase activity in rat hepaeic cells." Histochemistry. (1992)
• [文献書誌] 齋藤 多久馬: "初期発生と形態形成 新生理学大系:発生分化の生理学" 医学書院, 17-37 (1991)
• [文献書誌] Saito,T.& Fukushima,O.: "Electron Microscopic Cytochemistry of Enzymes Ultrathinーcryosection techniques" CRC Press, (1992)