光励起過程において引き起こされる急激なcGMP代謝酵素活性変動の二・三次元解析

1993 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 03454118
• 研究機関: 自治医科大学
• 研究代表者: 斉藤 多久馬 自治医科大学, 医学部, 教授 (40090419)
• 研究分担者: 増田 弥生 自治医科大学, 医学部, 助手 (20254906) ; 山門 誠 自治医科大学, 医学部, 助教授 (80010114)
• キーワード: 網膜 / 光受容情報処理 / 急速凍結置換 / 酵素細胞化学 / 電子顕微鏡 / CGMP / PDE / 5-N

研究概要

網膜視細胞外節円板膜に含まれるロドプシンの光励起はトランスヂューシンを活性化し、この活性化トランスヂューシンが更に3':5'-cyclic nucleotide phsphodiesterase(3',5'-PDE)を活性化して、細胞質中のcGMP濃度の急激な低下させることにより原形質膜のチャンネルを閉じ、過分極性のポテンシャルを生じると推定されている。我々はこの実態をを細胞化学的に証明しようと、急速凍結置換酵素細胞化学を開発し、cGMP代謝酵素guanylate cyclase (GC),GTPase,3',5'-PDE,5'-nucleotidase(5'-N)等の局在を証明すると共に、活性変動の実態を明らかにして来た。
この研究の基本は正しい局在を示す酵素活性検出にある。その意味で3',5'-PDE検出法は組織破壊が大きいので、蛇毒を精製5'-Nに変えた新しい細胞化学の方法を確立した。また急速凍結置換固定精度を上清酵素G6PDを例に検証し、急速凍結置換固定が酵素組織化学の検出に適していることを証明した。また3',5'-PDEの他に2',3'-PDEの存在が知られるので、この局在を検討し、5'-Nの活性をpH8.0でクエン酸鉛を補足剤にすると網膜色素上皮より外網状層までを強陽性に検出することを明らかにした。この活性陽性の範囲に視細胞全体が含まれる。
現在、細胞化学の活性はプラズマ重合レプリカ膜法、凍結割断法、凍結乾燥、クライオ走査電顕法によ観察を進めている。

研究成果

• [文献書誌] 斉藤多久馬: "Ultracytochemistry of enzymes in cell biology of the retina." J.Electron Microsc.,. 40. 312-318 (1991)
• [文献書誌] 斉藤多久馬: "The identification of an active enzyme site by rapid freeze substitution enzyme histochemistry on rat retina." Acta Histochem.Cytochem.24. 121-132 (1991)
• [文献書誌] 斉藤多久馬: "Lead citrate method of guanylate cyclase and its application to tissue receiving rapid freeze substitution fixation." Acta Histochem.Cytochem.25. 181-192 (1992)
• [文献書誌] 瀧澤俊広: "Improved cytochemical method for cyclic 3',5'-nucleotide phosphodi-esterase in rat rod outr segments." Acta Histochem.Cytochem.25. 697-705 (1992)
• [文献書誌] 斉藤多久馬: "Ultracytochemistry of glucose-6-phosphate dehydrogenase in adrenal gland." Okajima's Folia Anat.Nippon.69. 217-224 (1992)
• [文献書誌] 石橋敏光: "Ultracytochemical study of glucose-6-phosphate activity on cholestatic jaundice." J.Clin.Electron Microsc.25. 239-248 (1992)
• [文献書誌] 斉藤多久馬: "学際企画、日本組織細胞化学会編" 酵素検出のための組織化学の手技と応用(1)-凍結技法と酵素組織化学-、組織細胞化学1991. (1991)
• [文献書誌] 斉藤多久馬: "学際企画、日本組織細胞化学会編、" 凍結技法の導入による酵素組織化学の新しい展開組織細胞化学1992. (1992)
• [文献書誌] 小黒範子: "Effect of freezeing on cytochrome c oxidase cytochemistr in cells in monolayer culture." Acta Histochem.Cytochem.25. 523-531 (1992)
• [文献書誌] 瀧澤俊広: "凍結超薄切片による酵素組織化学" 細胞. 24. 566-570 (1992)
• [文献書誌] 斉藤多久馬: "SERの酵素細胞化学(G6Pase)." 生体の科学. 44. 655-658 (1993)
• [文献書誌] 石橋敏光: "Ultracytochemical study of glucose-6-phosphate dehydrogenase activity in rat hepatic cells." His'tochemistry. (Submitted). (1994)
• [文献書誌] 斉藤多久馬: "医学出版センター、日本電子顕微鏡学会電顕サマースクール実行委員会編" 細胞化学を始める人のために、電子顕微鏡の上手な使い方講座I. (1992)
• [文献書誌] 斉藤多久馬: "医学出版センター、日本電子顕微鏡学会電顕サマースクール実行委員会編" 生物試料作製と組織化学のポイント電子顕微鏡の上手な使い方講座II. (1992)
• [文献書誌] 斉藤多久馬: "CRC Press.Inc.,Eds.by Kazuo Ogawa and Tibor Barka." Ultrathin cryosection techniqes.In Electron Microscopic Cytochemistry and Immunocytochemistry in Bio-medicine.(1993)