| 研究課題/領域番号 |
03454135
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| 研究機関 | 富山医科薬科大学 |
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研究代表者 |
磯部 正治 富山医科薬科大学, 和漢薬研, 助手 (70211050)
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| 研究分担者 |
佐々木 和男 富山大学, 工学部, 助教授 (60042826)
大村 裕 富山医科薬科大学, 和漢薬研, 客員教授 (30019517)
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| キーワード | 線維芽細胞増殖因子 / FGF / 蛋白工学 / バキュロウイルス / 長期増強 |
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| 研究概要 |
本研究の初年度にあたり、まずバキュロウイルスベクタ-系を用いたbFGFの生合成ならびにその精製法の確立を行った。ラットbFGFの全構造遺伝子をバキュロウイルストランスファ-ベクタ-に組み込み野生型のバキュロウイルスゲノムとの間で相同組替えを行い、bFGF組替え型バキュロウイルスを得た。次にこのウイルスをsf9と呼ばれる昆虫細胞に感染させ、4日後上清および細胞を回収し、bFGFの精製を行った。得られたbFGFのN端に相当するアミノ酸配列を決定したところ、メチオニンから7つのアミノ酸が切りとられたbFGFであることが明かとなった。このbFGFは、ヘパリンに結合する能力を持ち、PC12細胞に作用して樹状突起の形成促進効果を示した。さらに現在C端領域を欠如した修飾型FGFの作製にも取り組んでいる。
FGFの中枢作用の検討(佐々木、大村):虚血による海馬錐体細胞の細胞死などに対しaFGFが阻害、修復効果を有することを明かとにした。また、aFGFによって、海馬錐体細胞層より記録されるポピュレ-ションスパイクの長期増強(脳切片を用いる)が引き起こされる事が明らかとなり、この系を用いた修飾型FGFの生理活性検討が可能となった。
今回われわれは、バキュロウイルスベクタ-を用いたbFGFの生合成法ならびに精製法を確立したが、FGFの精製には、ヘパリンに結合するといった性質を利用しているために、ヘパリン結合領域を削った修飾型FGFでは精製に困難さが予想された。そこでこの問題点を克服するためにマルト-ス結合タンパク質(MBP)にFGFの遺伝子を融合しN端にMBPを持つFGFを作製し、マルト-スとMBPの親和性を利用してMBPーFGF融合タンパク質を精製し、その後MBPとFGFをプロテア-ゼで切り離すことにより精製された修飾型FGFを得るといった方法の開発を試みている。
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