脳Clーポンプの精製と活性部位蛋白一次構造の解析

1991 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 03454148
• 研究機関: 関西医科大学
• 研究代表者: 稲垣 千代子 関西医科大学, 医学部, 教授 (60025640)
• 研究分担者: 原 満良 関西医科大学, 医学部, 助手 (50192282) ; 大森 京子 関西医科大学, 医学部, 講師 (90152256)
• キーワード: クロライドイオンポンプ / 脳

研究概要

本年度研究実施計画に添って実験を進め、次の成果を得た。
1)Cl^ーーATPaseの可溶化:ラット脳よりCl^ーーATPase活性の高いEDTA処理細胞膜分画を調整し、諸種界面活性剤によるCl^ーーATPase可溶化の条件を検討した。その結果、Cl^ーーATPaseは非イオン性界面活性剤であるMEGAー10により比較的安定に可溶化され、MEGAー10の0.5mg/ml(1mg/ml蛋白当たり)はCl^ーーATPaseのCl^ーおよびエタク酸に対する感受性を保ったまま、90%以上可溶化された。
2)Cl^ーーATPaseの部分精製:可溶化されたCl^ーーATPase粗標品をCM SepharoseおよびMonoーQーHPLC(0ー1 M NaCl勾配溶出)により部分精製し、0.35M NaClの位置にNa.KーATPaseを含まず、Cl^ーーATPaseとアニオン非感受性MgーATPaseを含む分画を得た。
3)電気泳動法によるCl^ーーATPaseの分離と分子量推定:MonoーQーHPLCのCl^ーーATPase活性ピ-ク近辺分画をポリアクリルアミドゲル電気泳動により展開すると、Cl^ーーATPase活性に伴って520KDaおよび580KDaの蛋白バンドが認められた。これらのバンドを切り出し、蛋白をゲルから電気泳動的に溶出・回収して、ATPase活性および再構成蛋白・脂質膜顆粒での ^<36>Cl^ー取り込み活性を測定したところ、粗標品の約20倍の活性が得られた。
これらの結果から、Cl^ーーATPaseは、MEGAー10により可溶化され、520KDaまたは580KDa蛋白として分離されることが明らかになった。

研究成果

• [文献書誌] M.Inoue et al.: "Ethacrynic acid-induced glutamate release from the mouse brain synaptosomes." Brain Research. 543. 160-162 (1991)
• [文献書誌] T.Uriu et al.: "Two types of clathrine-coated vesicles in the rat brain:Analysis for cellular origin" J.Neurochemistry. 56. 1543-1556 (1991)
• [文献書誌] M.Inoue et al.: "An ATP-driven Cl^- pump regulates Cl^- concentrations in hippocampal neurons." Neurosci.Lett.134. 75-78 (1991)
• [文献書誌] Y.Kunugi et al.: "An ATP-driven Cl^- pump in the rat kidney." Japan.J.Pharmacol.57. 167-174 (1991)
• [文献書誌] S.Ohnishi et al: "Delayed shortening and shrinkage of cochlear outer hair cells." Am.J.Physiol.
• [文献書誌] T.Hirose et al.: "Enflurane-induced relaese of excitatory amino acids from the mouse brain synapto-somes." Anesthesiology.
• [文献書誌] C.Inagaki et al.: "Eletrogenic Chloride Transporters in Biological Membranes." Springer-Verlag, (1992)