脳Cl^‐ポンプの精製と活性部位蛋白一次構造の解析

1993 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 03454148
• 研究機関: 関西医科大学
• 研究代表者: 稲垣 千代子 関西医科大学, 医学部, 教授 (60025640)
• 研究分担者: 三上 斗友子 (瓜生 斗友) 関西医科大学, 医学部, 助手 (40203608) ; 原 満良 関西医科大学, 医学部, 助手 (50192282) ; 大谷 ひとみ 関西医科大学, 医学部, 助手 (40140272) ; 大森 京子 関西医科大学, 医学部, 講師 (90152256)
• キーワード: クロライドイオンポンプ / 脳 / 蛋白一次構造

研究概要

本年度研究実施計画に添って実験を進め、次の成果を得た。
1、Cl^‐ポンプ活性部位の精製
(1)Cl^‐‐ATPase520kDa蛋白をCM‐セルロース、Mono‐Qカラム装着HPLCおよびポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、ゲルから溶出してレシチン+PIP_2膜顆粒に再構成したところ、ATP依存性Cl^‐輸送活性が確認された。HPLCのCl^‐‐ATPase活性分画に含まれる580kDaにも再構成後に同様の活性(比活性)が認められた。しかし同分画に含まれる100および200kDaの蛋白ではATP依存性Cl^‐輸送の比活性は、520kDa蛋白の場合の約1/2であった。
(2)Cl^‐‐ATPase520kDa蛋白に対して作成されたポリクローナル抗体をは、Cl^‐‐ATPase活性を阻害した。
(3)上記抗体(抗Cl^‐ポンプ抗体)は、Cl^‐‐ATPase520kDa蛋白の60kDaサブユニットと結合した。
以上の結果から、Cl^‐ポンプの60kDaサブユニットはCl^‐ポンプ活性部位である可能性が高い。
2、Cl^‐‐ATPase活性部位蛋白一次構造の解析上記Cl^‐ポンプの60kDaサブユニットをSDS‐PAGEウエスタンブロット膜上に採取して、気相アミノ酸シーケンサーにより分析したところ、N末端アミノ酸配列はSPGGGSISIPSGITHと推定された。

研究成果

• [文献書誌] Ohnishi,S: "Regulation of Cl^‐ conductance in delayed shortening and shrinkage of outer hair cells." Acta otolaryngol(Stockh). Suppl500. 42-45 (1993)
• [文献書誌] Zeng,X‐T: "Electrcgenic and phosphatidylinositol‐4‐monophosphate‐stimulated Cl^‐ transport by Cl^‐ pump in the rat brain." Brain Reseorch. (印刷中). (1994)
• [文献書誌] Omori,K.: "A cytosolic peptide potentiates the GTP effect on B‐aorenergic response at adenylak cyclase" American Journal of Physiology. (印刷中). (1994)
• [文献書誌] Hara,M.: "Spatial diversity of chloride transporters in hippocampal" Ann.N.Y.Acad.Sci.707. 421-423 (1993)
• [文献書誌] Inagaki,C.(分担): "Electrogenic chloride Transporters in Biological Membranes" Springer‐Verlag, 500(20) (1994)
• [文献書誌] 大谷ひとみ.稲垣千代子(分担): "分子循環器学(心筋クロライドチャネル)" 日本臨床, 270 (1993)