| 研究課題/領域番号 |
03454148
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| 研究種目 |
一般研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
薬理学一般
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| 研究機関 | 関西医科大学 |
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研究代表者 |
稲垣 千代子 関西医科大学, 医学部, 教授 (60025640)
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| 研究分担者 |
三上 斗支子 関西医科大学, 医学部, 助手 (40203608)
原 満良 関西医科大学, 医学部, 助手 (50192282)
大谷 ひとみ 関西医科大学, 医学部, 助手 (40140272)
井上 雅史 関西医科大学, 医学部, 講師 (90203257)
大森 京子 関西医科大学, 医学部, 講師 (90152256)
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| 研究期間 (年度) |
1991 – 1993
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| キーワード | クロライドイオンポンプ / 脳 / 蛋白一次構造 / 神経細胞 |
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| 研究概要 |
1.Cl^-ポンプの精製:非イオン性可溶化剤MEGA-10は、ラット脳から調整した細胞膜顆粒のNa^+,K^+-ATPaseをほぼ完全に、またanion-insensitive ATPaseを部分的に失活させたが、Cl^--ATPaseを失活させずに可溶化し、可溶化後のCl^--ATPaseは阻害剤エタクリン酸に対する感受性を保持していた。可溶化したCl^--ATPaseを、CM-SepharoseおよびMonoQ-HPLCにより分画し、活性ピークのポリアクリルアミド電気泳動によりCl^--ATPase活性分布に対応する520kDaおよび580kDaの蛋白を採取した。
2.再構成したCl^-ポンプのCl^-輸送形式:MEGA-10により可溶化したCl^--ATPaseを、レシチン膜顆粒に再構成し、ATP依存性Cl^-輸送活性を検出することに成功した。再構成膜にはレシチンのほかリン脂質としてphosphatidylinositol-4-monophosphateを加えることが、より選択的なCl^--ATPaseの再構成を可能にした。Cl^--ATPase再構成膜におけるATP依存性Cl^-輸送は、エタクリン酸、フロセミドおよびバナジン酸に対して細胞膜顆粒の場合と同様の感受性を示し、さらにK^+イオノフォアと40mM K^+、またはH^+イオノフォア共存により促進されたので、Cl^--ATPaseによる起電的Cl^-輸送であると推定された。520kDa蛋白は細胞膜顆粒に比べ約20倍のCl^-ポンプ活性を示した。
3.Cl^-ポンプのサブユニットと蛋白一次構造:520kDaのSDS-ポリアクリルアミド電気泳動(SDS-PAGE)により、少なくとも4種のサブユニット(110kDa、97kDa、60kDa、47kDa)が認められた。520kDa蛋白を抗原として作製したウサギ抗血清は、60kDaサブユニットに結合し、Cl^--ATPase活性を阻害した。520kDa蛋白のSDS-PAGE展開後のポリペプチドを電気泳動的にニトロセルロース膜に移し、60kDaポリペプチドを気相プロテインシーケンサーにて分析したところ、N末端アミノ酸配列はSPGGGSISIPSGITHと推定された。
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