ヒトホメオボックス蛋白に対する抗体を用いた細胞の増殖と分化に関する研究

1991 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 03454175
• 研究機関: 東海大学
• 研究代表者: 守内 哲也 東海大学, 医学部, 助教授 (20174394)
• 研究分担者: 谷口 泰史 東海大学, 医学部, 助手 (30207188) ; 吉村 眞一 東海大学, 医学部, 助手 (30230808)
• キーワード: ホメオボックス蛋白 / 大腸菌発現ベクタ- / マルト-ス結合蛋白 / 蛋白精製

研究概要

ヒトホメオボックス蛋白に対する抗体を作製し、正常組織、がん組織等におけるホメオボックス蛋白の発現状態を検索する第一段階としてヒトホメオボックス蛋白の大量発現と精製を行った。最初、Hox4B遺伝子のcDNA(c13クロ-ン)全体を大腸菌発現ベクタ-に組込んだがホメオボックスの領域が欠損したプラスミドを持つ菌のみがトランスフォ-ムした。ホメオドメイン蛋白が発現すると大腸菌が発育しないことが予測されたので、Hox4B遺伝子のcDNA(c13クロ-ン)を二つに分割し、N末端側のアミノ酸をコ-ドする領域とC末端側のホメオドメインをコ-ドする領域を別々に大腸菌発現ベクタ-に組込んだ。1.N末端側のアミノ酸をコ-ドする領域はベクタ-pMALーpに組込まれ、大腸菌をトランスフォ-ムさせることができた。C末端側のホメオドメインをコ-ドする領域をベクタ-に組込んだものは:予想どおり大腸菌をトランスフォ-ムさせなかった。
2.Hox4BのcDNAのN末端側の450bpを大腸菌発現ベクタ-pIH888(pMALーp:New England Biolabs)に組込むことに成功し、マルト-ス結合蛋白との融合蛋白として発現させ、大腸菌のペリプラスムに分泌させることに成功した。細胞抽出物中の発現蛋白質を交鎖結合アミロ-ス樹脂のカラムに結合させた後、遊離マルト-スを加えることによって溶出しようとしたが、融合蛋白になるとマルト-ス結合蛋白の交鎖結合アミロ-ス樹脂に結合力が低下してこの方法では精製できないことが実験的に明らかになった。
3.そこで分子量5700の融合蛋白をデイスク・プレパラテイブゲル電気泳動によって分画して精製することに成功した。この抗原を家兎およびマウスに免疫し、ポリクロ-ナルおよびモノクロ-ナル抗体を作成する。

研究成果

• [文献書誌] Yamaguchi,M.: "Molecular cloning and structural analysis of mouse gene and pseudogenes for proliferating cell nuclear antigen." Nucleic Acids Res.19. 2403-2410 (1991)
• [文献書誌] Yoshimura,S.: "Tissue specific expression of the plasma glutathione peroxidase gene in rat kidney." J.Biochem.109. 918-928 (1991)
• [文献書誌] Taniguchi,Y.: "Structural analysis of the human HOX4A homeobox gene." Nucleic Acids Res.(Symp.Ser.). 25. 31-32 (1991)
• [文献書誌] Yoshimura,S.: "Molecular cloning of human plasma glutathione peroxidase gene and expression in the kidney." Nucleic Acids Res.(Symp.Ser.). 25. 163-164 (1991)
• [文献書誌] Ohashi,Y.: "Analysis of the 5'flanking region of the rat proliferating cell nuclear antigen (PCNA) gene." Biochem.Biophys.Acta,.
• [文献書誌] 石渕 敏明: "病理学研究のための臓器DNAバンク" 病理と臨床・別冊. 9. 1467-1471 (1991)
• [文献書誌] Yoshimura,S.: "5th Internacional Congress on Oxigen Radicals" Elsevier Science Publishers,