ヒトホメオボックス蛋白に対する抗体を用いた細胞の増殖と分化に関する研究

1992 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 03454175
• 研究機関: 東海大学
• 研究代表者: 守内 哲也 東海大学, 医学部, 助教授 (20174394)
• 研究分担者: 谷口 泰史 東海大学, 医学部, 助手 (30207188) ; 吉村 眞一 東海大学, 医学部, 助手 (30230808)
• キーワード: ヒト / 発生 / ホメオボックス / リコンビナント / 抗体 / 免疫組織化学

研究概要

1.Hox4B cDNA全体の大腸菌における発現
最初の実験では、Hox4B遺伝子cDNAの全体を発現ベクターpIH888プラスミドに挿入した。この組み換えDNAを大腸菌に遺伝子導入した場合、菌は増殖せず、ホメオボックスが大腸菌にとってtoxicと考えられた。
2.ホメオボックスを除いたHox4B蛋白前半部の大腸菌による産生
toxic sequenceと考えられるホメオボックス配列を取り除き、Hox4B遺伝子をホメオボックスを含まない前半部をpIH888プラスミドに組み換え、大腸菌を形質転換させることに成功した(pIH 4Bb)。次いで、pIH 4BbのHox4B遺伝子の直後に翻訳終止コドンTAGを導入した(pIH 4Bc)。発現ベクターとHox4B遺伝子の結合部について塩基配列を決定した結果、Hox4B遺伝子が設計通りにpIH888プラスミドに挿入され、なおかつそのアミノ酸配列を崩さずに融合蛋白が産生されている事が確認された。このpIH 4Bcを大腸菌に遺伝子導入し、増殖させた大腸菌よりペリプラスム蛋白を調整し、SDS-PAGEにて電気泳動して蛋白質を染色したところ、57KDaの濃い一本の融合蛋白のバンドが染色された。
3.抗Hox4B抗体の作成
57KDaの蛋白をプレパラテイブ・ゲル電気泳動で選択的に回収し、家兎に免疫して抗体を得て、アフィニテイーカラムでさらに精製した。
4.イムノブロット解析
受精後13日のマウス胎仔のホモジネートを用いてイムノブロットを行ったところ、64KDaのバンドが一本だけ検出され、この抗体の特異性が確認された。
5.マウス胎仔のパラフィン切片を抗Hox4B抗体で免疫染色したところ、幼若な軟骨細胞、脊髄神経細胞、および副腎髄質が染った。この結果に基づき、現在ヒト副腎および褐色細胞腫の免疫染色を行っている。

研究成果

• [文献書誌] Y.Taniguchi: "Structural analysis of the human HOX4A Homeobox gene." Nucleic Acids Res.(Symp.Ser.). 25. 31-32 (1991)
• [文献書誌] M.Yamaguchi: "Molecular cloning and structural analysis of mouse gene and pseudogenes for proliferating cell nuclear antigen." Nucleic Acids Res.19. 2403-2410 (1991)
• [文献書誌] S.Yoshimura: "Tissue specific expression of the plasma glutathione peroxidase gene in rat kidney." J.Biochem.109. 918-923 (1991)
• [文献書誌] Y.Ohashi: "Analysis of the 5'flanking region of the rat proliferating cell nuclear antigen(PCNA)gene." Biochimica et Biophysica Acta. 1130. 175-181 (1992)
• [文献書誌] Y.Taniguchi: "The biochemical basis of lithium-induced morphogenetic changes." Lithium. 3. 249-257 (1992)
• [文献書誌] Y.Taniguchi: "Cloning and sequencing of the human homeobox gene HOX4A." Biochimica et Biophysica Acta. 1132. 332-334 (1992)
• [文献書誌] S.Yoshimura: "Oxygen Radicals (K.Yagi,M.Kondo,E.Niki and T.Yoshikawa,eds)." Elsevier Science Publishers, 846 (1992)