ミトコンドリア異常症の分子遺伝学的病態解析、及び、遺伝子診断法、治療法の確立

1991 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 03454269
• 研究機関: 自治医科大学
• 研究代表者: 桃井 真里子 自治医科大学, 医学部, 助教授 (90166348)
• 研究分担者: 小黒 範子 自治医学大学, 医学部, 助手 (10214107) ; 市橋 光 自治医学大学, 医学部, 助手 (70213006) ; 下泉 秀夫 自治医学大学, 医学部, 助手 (30196547) ; 香川 靖夫 自治医学大学, 医学部, 教授 (30048962)
• キーワード: ミトコンドリア異常症 / MELAS / ミトコンドリアDNA / 母系遺伝 / ミトコンドリアtRNAーLeu

研究概要

ミトコンドリア脳筋症のうちでも小児科領域に症例の多い、mitochondrial myopathy,encephalopathy,lactic acidosis and strokelike episodes(MELAS)の病態解析を行った。
(1)MELAS患者骨格筋を癌遺伝子導入法にてクロ-ン化し、ミトコンドリア内電子伝達系酵素の一つであるチトクロ-ムc酸化酵素(COX)活性に関して正常である細胞と酵素活性欠損細胞を得た。これらは同一個体より得た細胞であるために、ミトコンドリアDNAの塩基配列に関しては等しく、差がある場合はCOX活性欠損と関連した塩基変異であると想定された。以上の細胞のミトコンドリアDNAの全塩基配列を決定することで、MELAS関連遺伝子変異を同定した。ミトコンドリアDNA上のtRNAーLeu(UUR)遺伝子上のAーG 置換であり、これ以外の塩基配列はすべて2細胞間で同一であった。
(2)上記のクロ-ン化細胞からミトコンドリアDNAをクロ-ニングし、正常ミトコンドリアCNAと変異を有するミトコンドリアDNAを単離した。これらを一定量比で混在させた試料をPCR増幅し、制限酵素ApaIで切断し、非切断断片(正常DNA)と切断断片(変異DNA)をゲル上で分離し、定量した。理論的量比と定量後の量比を求め、実験系の定量性を検討した。相関係数0.99で上記方法で正常DNAと変異DNAの量比を定量可能なことを示した。
(3)この方法にて、MELAS患者の家系解析と剖検組織の変異DNA局在を検討した。リンパ球においては患者の母親はすべて変異DNAを有しており、変異DNAは世代を経て増幅されていることを明らかにした。また、患者において変異DNAはすべての組織に存在する者の、組織間の量は大きく異なることを示した。以上から、1ミトコンドリアDNAに生じたMELAS関連遺伝子変異は世代を経て増幅し、組織間での増幅率に差があることが明かとなった。今後この変異遺伝子の選択的増幅機構の解析がミトコンドリア異常症発生の分子細胞学的解明につながることが明かとなった。

研究成果

• [文献書誌] Kobayashi Y,Momr,MY,Tominaga K,et al.: "A point meetation in the mitochonduial tRNA^<Leu>(uuR)gene in MELAS." Biochem Biophys Res Commun. 173. 816-822 (1990)
• [文献書誌] Kobayashi Y,Momoi MY,Tominaga K,et al.: "Respirationーdeficient cells are caused by a single point mutation in the mitochondrial tRNAーLen(uuR)gene in mitochondrial ryopathy,encephalopathy,laitic aidosis are strobilihc episodes." am J Hum Genet. 49. 590-599 (1991)
• [文献書誌] Kabayashi Y,Momoi MY,Ichihusui K,et al.: "The amplification of the mutont genes in mitochondrial myopatry,encephalopathy,lactic acicdosis and strokelike episodes," J,Inherit,Metab,Dis.(1992)
• [文献書誌] Kobayashi Y,Momoi MY,Itoh S,et al.: "The widespread distirb eition of the deleted mitochonduial DNA in Pearson syndrome." J,Neural,Sci.(1992)