相同的組換えによる遺伝子破壊に基づくDNAトポイソメラーゼの機能解析

1993 年度 研究成果報告書概要

• 研究課題/領域番号: 03454496
• 研究種目: 一般研究(B)
• 配分区分: 補助金
• 研究分野: 生物系薬学
• 研究機関: 愛知県がんセンター
• 研究代表者: 安藤 俊夫 愛知県がんセンター, 生化学部, 部長 (20012693)
• 研究分担者: 中村 普武 愛知県がんセンター, 分子生物研究室, 室長 (30109938) ; 清水 暁 愛知県がんセンター, 病態研究室, 室長 (10073123) ; 小祝 修 愛知県がんセンター, 生化学部, 主任研究員 (50132923)
• 研究期間 (年度): 1991 – 1993
• キーワード: DNAトポイソメラーゼ / RFLV / 遺伝子破壊 / 相同的組換え

研究概要

哺乳類動物のDNAトポイソメラーゼ(トポ)Iの生理機能を細胞レベルと個体レベルで明らかにする事を目的とし、次の実験を順次行い次の結果を得た。(1)ヒトトポIのcDNAをプロープとしてマウストポIcDNAクローンを得た。塩基配列の決定、アミノ酸配列の推定を行い、ヒトトポIのそれと比較した所、96%同一アミノ酸で相同性を示した。その機能的重要性を示す。(2)クローン化cDNAを用いて、マウストポI遺伝子の染色体上の位置をRFLV法を用いて決定した。即ち、実験用マウスNOD,CBA/KIと野生マウスMOL-MITの間で制限酵素HindIII切断パターンの変化(Restriction endonuclease Fragment Length Variation,RFLV)と三点検定交配の解析より、トポI遺伝子は、第2染色体の54.5にユニーク遺伝子としてマップされた。ヒトゲノムで検出された擬遺伝子はマウスでは認められなかった。(3)マウスcDNAをプローブにして、マウスの精子DNAからのCharon4Aゲノムライブラリーをスクリーニングし、exon4から8までを含むクローン2個を得た。exon7に存在するEcoVのユニークな切断部位を利用して、Neo耐性遺伝子とTK遺伝子をそれぞれ挿入した遺伝子破壊に用いるためのプラスミドの構築を行った。マウスの胚性腫瘍EC細胞にこのプラスミドの導入を行い形質転換株〜30株を取得した。PCR法により相同組換えを検討したが、現在までの所、得られなかった。

研究成果

• [文献書誌] Tamura,H.,Kohchi,C.,Koiwai,O.,Andoh,T.et.al.: "Molecular cloning of a cDNA of a camptothecin-resistant human DNA topoisomerase I and identification of mutation sites." Nucl.Acids Res.19. 69-75 (1991)
• [文献書誌] Ishimi,Y.,Nishizawa,M.& Andoh,T.: "Characterization of a camptothecin-resistant human DNA topoisomerase I in an in vitro system for Simian Virus 40 DNA replication." Eur.J.Biochem.202. 835-839 (1991)
• [文献書誌] Tanabe,K.,Ikegami,Y.,Ishida,& Andoh,T.: "Inhibition of topoisomerase II by antitumor agents bis(2,6-dioxopiperazine)derivatives." Cancer Res.51. 4903-4908 (1991)
• [文献書誌] Ishida,R.,Maki,T.,Andoh,T.et.al.: "Inhibition of Intracellular topoisomerase II by antitumor bis(2,6-dioxopiperazine)derivatives.Yui,R.:Mode of cell growth inhibition distinct from that of cleavable complex-forming type inhibitor." Cancer Res.51. 4909-4916 (1991)
• [文献書誌] Ishimi,Y.,Ishida,R.& Andoh,T.: "Effects of ICRF-193,a novel DNA topoisomerase II inhibitor,on Simian Virus 40 DNA and chromosome replication in vitro." Molec.Cell.Biol.12. 4007-4014 (1992)
• [文献書誌] Ono,K.,Ikegami,Y.,Nishizawa,M.& Andoh,T.: "Menogaril,an anthracycline derivative,inhibits DNA topoisomerase II by stabilizing clevable complexes." Jpn.J.Cancer Res.83. 1018-1023 (1992)
• [文献書誌] Matsumoto,K.,Sugawara,I.,Takahashi,T.& Andoh,T.: "Injection of antitopoisomerase I IgG into nuclei of mouse L929 cells leads to inhibition of transcription of exogeusly introduced SV40 large T antigen gene." Exptl.Cell Res.204. 6-10 (1993)
• [文献書誌] Koiwai,O.,Yasui,Y.,Watanabe,T.,Andoh,T.et.al.: "Cloning of the mouse cDNA encoding DNA topoisomerase I and chromosomal location of the gene." Gene. 125. 211-216 (1993)
• [文献書誌] Roca,J.,Ishida,R.,Andoh,T.,Wang,J.C.et.al.: "Antitumor bisdioxpiperazines inhbit yeast DNA topoisomerase II by trapping the enzyme in the form of a closed protein clump." Proc.Natl.Acad.Sci.USA.91. 1781-1785 (1994)