トロンボモジュリンの抗凝固作用とエンドサイトシスにおける構造・機能相関の解析

1992 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 03454547
• 研究機関: 三重大学
• 研究代表者: 鈴木 宏治 三重大学, 医学部, 教授 (70077808)
• キーワード: トロンボモジュリン / プロテインC / トロンビン / 機能ドメイン / EGF様ドメイン / 血管内皮細胞 / ホモシステイン / 遺伝子発現機構

研究概要

トロンボモジュリン(TM)は血管内皮細胞上のトロンビンレセプターで、トロンビンによる凝固制御因子プロテインC(PC)の活性化促進因子(コファクター)として機能する。研究代表者らは、これまでにヒトTMcDNAの構造解析から、TMは特徴的な複数のドメイン構造から構成されており、TM分子内に存在する6個の上皮増殖因子(EGF)様ドメインの内、N末端側から第4、第5および第6EGF様ドメインがTMのコファクター活性の発現に重要であること、その内の第4EGF様ドメインにPCがCa^<2+>を介して結合し、トロンビンは第5EGF様ドメインに結合することを報告した。また、TM遺伝子の発現が各種サイトカインやc-AMPなどで制御調節されていることを報告した。本年度は、以下の研究を目的とした。(1)TMの第4EGF様ドメイン内のアミノ酸を変異させた改変型TMを作製し、PCの活性化能に及ぼす影響の検討。(2)動脈硬化促進因子の一つホモシステインの内皮細胞TMの発現に及ぼす影響。(3)TM遺伝子の発現調節機構の解析のためTM遺伝子の5'上流のプロモーター領域を単離し構造を解析する。結果:(1)TMの第4EGF様ドメイン内のAsp349をAlaに改変したTM(DA)およびAsp349をGluに改変したTM(DE)を作製し、TM存在下でのCa^<2+>依存性のPCの活性化能を検討した結果、TM(DA)では野生型TMと異なり、Ca^<2+>依存性のPC活性化能が消失したが、TM(DE)には野生型TMと同様のPC活性化能が認められ、TMの第4EGFドメインのAsp349近傍にCa^<2+>を介したPC結合部位の存在が示唆された。(2)ホモシステインは内皮細胞表面TMを失活化し、TMmRNAの発現を促進して機能異常TMを細胞表面に発現することを明らかにした。(3)TM遺伝子のプロモーター領域を単離し、この領域の構造と遺伝子発現の関係を解析している。また、最終年度にあたり本研究を総括した。

研究成果

• [文献書誌] Zushi,M.,Gomi,K.,Yamamoto,S.,Maruyama,I.,Hayashi,T.,Suzuki,K.: "The last three consecutive epidermal growth factor-like structures of human thrombomodulin comprise the minimum functional domain for proteinC-activating cofactor activity and anticoagulantactivity." J Biol Chem. 264. 10351-10353 (1989)
• [文献書誌] Kodama,S.,Uchijima,E.,Nagai,M.,Mikawatani,K.,Hayashi,T.,Suzuki,K.: "One-step enzyme immunoassay for soluble thrombomodulin using monoclonalantibodies." Clin Chim Acta. 192. 191-200 (1990)
• [文献書誌] Hayashi,T.,Suzuki,K.: "Monoclonal antibodies for human thrombomodulin which recognize binding sites for thrombin and protein C." J Biochem(Tokyo). 108. 874-878 (1990)
• [文献書誌] Hayashi,T.,Zushi,M.,Yamamoto,S.,Suzuki,K.: "Further localization of binding sites for human thrombin and protein C in thrombomodulin." J Biol Chem. 265. 20156-20159 (1990)
• [文献書誌] Zushi,M.,Gomi,K.,Honda,G.,Kondo,S.,Yamamoto,S.,Hayashi,T.,Suzuki,K.: "Aspartic acid 349 in the fourth epidermal growth factor-like structure of human thrombomodulin plays a role in itsCa^<2+>-mediated binding to protein C." J Biol Chem. 266. 19886-19889 (1992)
• [文献書誌] Hayashi,T.,Honda,G.,Suzuki,K.: "An atherogenic stimulus homocysteine inhibits cofactor activity of thrombomodulin and enhances thrombomodulin expression in human umbilical vein endothelial cells." Blood. 79. 2930-2936 (1992)
• [文献書誌] Fujikawa K,Suzuki K: "Recent Advances In Blood Coagulation(Cellular coagulant and anticoagulant proteins.)" Churchill Livingstone,Edinburgh,(ed.by L.Poller), 316(17) (1991)
• [文献書誌] Suzuki K: "Hemostasis and Circulation(Molecular interaction between thrombin and thrombomodulin in the protein C pathway.)" Springer-Verlag,Tokyo,(eds.by A.Takada,A.Z.Budzynski), 212(7) (1992)