色素性乾皮症D群の相補遺伝子のクロ-ニング

1991 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 03454552
• 研究機関: 神戸大学
• 研究代表者: 藤原 美定 神戸大学, 医学部, 教授 (70030848)
• 研究分担者: 松本 明 神戸大学, 医学部, 講師 (80181759)
• キーワード: 色素性乾皮症 / DNA除去終復 / DNA修復欠損 / D群相補遺伝子

研究概要

色素性乾皮症のD相補群(XPD)は,世界的に頻度が高く,高発癌性で,紫外線(LIV)損傷をほぼ完全に欠損する.XPD細胞のLIV高感変性とDNA除去修傷欠損を相補する置伝子をクロ-ニングすることは、XPDの遺伝性突然変異を明らかにし,XPDタンパクの機能を知る上で大切である。本研究では,第一に日本人XPDのXP59TO線維芽細胞を複製原点の欠失変異をもつSV40断片(pSVΔOri)で形質転換し,不死化クロ-ンを得た。このクロ-ンのLIV感変性は親株と同一(n=1.0,D_1(平均致死線量)=0.75/m^2)の高感変性であった。第二に,ヒト正常cDNAライブリ-(pCD)およびネオマイシン耐性遺伝子を発現するpCD2ライブラリ-を数回大スケ-ルで導入した。コンプレキシティ-が低く,pCRで増巾できるcDNA組込み乾換株が得られなかった。そこで,正常cDNAが一方向に挿入され,LTRプロモ-タ-で発現され,かつneo遺伝子をもち,プラスシド回収ができるλpCライブラリ-を用いて,導入・形質転換実験を3回(10^8細胞)行った。その結果,二次選択で20個,さらにLIV生存曲線スクリ-ニングで3個(D_0=1.7,1.7,2.0J/m^2)を選択した。そのうち,1クロ-ンがneo断片をもつ安定なクロ-ンとして得られた。現在プラスシド回収を行うと同時に,そのゲノムDNAをcDNA挿入部の5'と3'ベクタ-配列の人工合成PCRプライマ-を用いて増巾した。このcDNAがXPD細胞を相補するかを知るために必要なクロ-ンを得るために,このPCR増巾断片を用いて,ネオマイシン耐性遺伝子を発現するpCD2ライブリ-から選択とクロ-ニングを行っている。今後cDNAがクロ-ニングできると,その構造解析が期待できる。

研究成果

• [文献書誌] Fujiwara,Y.,Ichihashi,M.,Matsumoto,A.,and Kataoka H.: "A Mechanism for relief of replication block by activation of unused origins and ageーdependent change in the caffeine susceptibility in xeroderma pigmentosum variant." Mutation Research. 254. 79-87 (1991)
• [文献書誌] Kataoka,H.and Fujiwara,Y.: "UV damage specific DNA binding protein in xeroderma pigmentosum complementation group E." Biochem.Biophys.Res.Commun.175. 1139-1143 (1991)
• [文献書誌] Nakamura,T.,Ono,T.,Yoshimura,K.,Arao,T.Ichihahsi,M.& Fujiwara,Y.: "Malignant Schwannoma associated with xeroderma pigmentosum in a patient belonging to complementation group D." J.of Amercian Academy of Dermatology. 25. 349-353 (1991)
• [文献書誌] Jimbo,P.,Ichihashi,M.,Mishima,Y. & Fujiwara,Y: "Role of excision repair in UVBーinduced depletion and recovery of human epiderma Langerhans cells." Arch.Dermatol. 128. 61-67 (1992)
• [文献書誌] Fujiwara,Y.and nakamura M.: "A new anticancer platinum compound DWA2114R:DNA interstrand crossーlinking,repair and lethal effects in normal and repair deficient human cells." Cancer Res.