ヒト正常2倍体細胞及びマウス脳における増殖停止誘導遺伝子の単離

1991 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 03454556
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 鮎沢 大 東京大学, 応用微生物研究所, 助教授 (00142109)
• 研究分担者: 大石 道夫 東京大学, 応用微生物研究所, 教授 (00126004)
• キーワード: 不死化遺伝子 / 染色体導入 / 染色体マッピング / 不死化細胞 / アンチセンスcDNAライブラリ-

研究概要

ヒト線維芽細胞の不死化遺伝子の同定・分離の研究の進捗状況は以下のとおりである。
I.染色体導入による不死化遺伝子の染色体マッピング。
相補性テストによりD群に所属する不死化細胞株KMST及びSUSー1について、RFLP解析を全染色体について行なったところ、1番、7番、11番、16番染色体に部分的あるいは全体のloss of heterozygosiyが認められた。そこで、ミニセル融合法を用いて上記の染色体移入を行なったところ、特定の染色体はKMSTとSUSー1細胞の増殖を抑制あるいは停止させた。しかし、同時に増殖能の低下しないクロ-ンも一定の割合で生じたので、染色体パネル細胞と染色体を導入したクロ-ンの核型の解析を行ない、その原因を調べている。ちなみに、増殖抑制を起こす染色体はA,B,C群に属する不死化細胞の増殖には何の影 響も及ぼさなかった。
II.アンチセンスcDNAライブラリ-の導入による不死化細胞の分離。
老化ヒト線維芽細胞で誘導されるmRNAを濃縮し、ランダムプライム法によりcDNAへ変換後、高発現ベクタ-へ組み込んだ。このライブラリ-と一緒にブラストサイジンS耐性(bsr)遺伝子を含むプラスミドをSV40線維芽細胞へコトランスフェクションを行ない、約10,000個のbsrコロニ-を分離した。ついで、3回の遺伝子導入実験を行ない10^5個以上のアンチセンスcDNAを組み込んだ独立クロ-ンを作成した。1回目の導入実験から約100個のコロニ-を単離し、その増殖特性を調べたところ、1個のコロニ-は増殖停止期を過ぎても正常に増殖しており(30代以上延長)、3個のコロニ-は増殖速度の低下を示すが増殖を続けている(20代以上)。
以上の結果より、当初の研究計画はおおむね順調に進行している。

研究成果

• [文献書誌] Takahashi,E.,Ayusawa,D.,Kaneda,S.,Itoh,Y.,Seno,T.& Hori,T.: "The human ubiquitinーactivating enzyme El gene(UBE1)mapped to band Xp.11.23ーp11.3 by fluorescence in situ hybridization." Cytogenet.Cell Genet.(1992)
• [文献書誌] Kaneda,S.,Horie,N.,Takahashi,K.,Takayanagi,A.,Seno,T.& Ayusawa,D.: "Promoterーspecific regulatory sequence in the human thymidylate synthase gene clustered at the 5'ーend of the first intron." J.Biol.Chem.(1992)
• [文献書誌] Ayusawa,D.,Kaneda,S.,Itoh,Y.,Yasuda,H.,Murakami,Y.,Sugawara,K.,Hanaoka,F.& Seno.: "Mouse FM3A cellーcycle mutant with thermolabile ubiquitinーactivating enzyme,as arrested in the 5ーphase and corrected by cloned human E1 cDNA" Cell Struc.Func.(1992)
• [文献書誌] Hara,T.,Takahashi,E.,Yamauchi,M.,Hoshino,M.,Aoki,K.,Hori,T.,Kawakita,M.& Ayusawa,D.: "The UDPーgalactose translocator gene is mapped to the WiskottーAldrich syndrome locus of the X chromosome."
• [文献書誌] Takayanagi,A.,Kaneda,S.,Ayusawa,D.& Seno,T.: "Intron 1 and 5'ーflanking region of the human thymidylate synthase gene as a determinant of cellーcycle dependent posttranscriptional regulation."