| 研究課題/領域番号 |
03554021
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| 研究機関 | 九州大学 |
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研究代表者 |
大野 素徳 九州大学, 理学部, 教授 (30038434)
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| 研究分担者 |
木原 大 宝酒造(株), バイオ研究所, 次長
服部 正策 東京大学, 医科学研究所, 講師 (00164864)
下東 康幸 九州大学, 理学部, 助手 (00211293)
青柳 東彦 九州大学, 理学部, 助教授 (80037267)
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| キーワード | ハブ血液 / ハブ毒酵素結合タンパク質 / 塩基性タンパク質I / T_2-プロテア-ゼ / 塩基性タンパク質I結合タンパク質 / T_2-プロテア-ゼ結合タンパク質 |
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| 研究概要 |
本年度の研究では、徳之島ハブ毒の塩基性タンパク質I(Lys-49-ホスホリパ-ゼA_2)及びT_2-プロテア-ゼに結合する徳之島ハブ血清タンパク質の精製を行った。徳之島ハブ20匹より血液(180ml)を集め、血清をとり、50%硫安飽和の沈殿画分を集めた。
(1)塩基性タンパク質Iに結合する血清タンパク質の精製
50%硫安沈殿画分を透析し、DEAE-セルロ-スカラムにかけ(pH5.8)、塩化ナトリウムによる段階的溶出を行った。0.2M塩化ナトリウム溶出画分を、塩基性タンパク質Iを固定化したセファロ-ス4Bカラムにかけ(pH5.8)、0.5M塩化ナトリウムで溶出後、酢酸の濃度勾配(0.05〜0.5M)の溶出を行った。溶出タンパク質をMonoQカラム(pH5.8)にかけ、ついで逆相HPLCで精製した。分子量25,000の糖タンパク質で、N端アミノ酸配列はAsp-49-ホスホリパ-ゼA_2に結合するタンパク質のそれとは異なっていた。
(2)T_2-プロテア-ゼに結合する血清タンパク質の精製
奄美大島ハブ毒のH_2-プロテア-ゼに相当するプロテア-ゼをT_2-プロテア-ゼと命名した。50%硫安沈殿画分を、DEAE-セルロ-ス(pH8.5)にかけた。0.2M塩化ナトリウム溶出画分をT_2-プロテア-ゼを固定化したカラムにかけ、(1)の場合と同様に溶出を行った。酢酸濃度勾配で溶出される画分を逆相HPLCにかけ、二つの成分を得た。一つは分子量65,000で糖を含み、T_2-プロテア-ゼを阻害した。第二の成分は分子量28,000で、等電点は3.9であった(結合活性は未確認)。
一方、ハブ粗毒及びAsp-49-ホスホリパ-ゼA_2の筋組織(マウス)への影響の病理組織学的観察を行った。この観察と組織マ-カ-酵素の血中濃度の測定から、ハブ毒酵素結合タンパク質の活性検定が可能であることを認めた。
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