タンパク質合成過程で変性・沈殿した酵素を溶解後正しくrefoldする手段の試験

1993 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 03555180
• 研究機関: 名古屋市立大学
• 研究代表者: 酒井 朝也 名古屋市立大学, 薬学部, 教授 (00080169)
• 研究分担者: 福原 健一 味の素(株), 中央研究所, 主任研究員 ; 栗本 英治 名古屋市立大学, 薬学部, 助手 (90234575) ; 黒田 良孝 名古屋市立大学, 薬学部, 講師 (40080204) ; 野原 大輔 名古屋市立大学, 薬学部, 助教授 (60080214)
• キーワード: サブチリシン / リボヌクレアーゼ / グアニジン塩酸塩 / リフォールディング / 球状タンパク質 / 組換えDNA法 / 固定化 / 変性剤

研究概要

本研究の目的は、6M guanidinium chloride(GdnHCl)などに溶解し、random coil上になった球状タンパク質をrefoldingするに当たって、(1)hydrophobic coreを先ず形成させる、(2)N末を固定し、C末側からrefoldさせる、(3)C末を固定し、N末側からrefoldさせる、という3手段についてrefoldingにおける優劣を比較することにある。本年度は本試験研究の最終年度として(3)の手段を試験し、その結果を踏まえて上記3手段の優劣を比較した。
実験に採り上げた酵素はbovine pancreatic ribonuclease A(RNase)とBacterial protease subtilisin BPN'(Sbt)で有意な結果が得られたのは後者である。固定化担体にはPharmaciaのEAH-Sepharose 4Bを用いた。
RNaseのC末固定に失敗した分けは、直接的には固定化により活性が失われたためで、この理由はおそらくSepharose 4B上のアミノ基がRNaseのC末とpeptide結合すべきところを、RNase分子内の近くにあるcarboxyl基とamino基がもっと速く結合したためであると思われる。
Sbtlを用いると(2)のN末固定Sbtlの場合に比べて固定化に伴う活性低下は大きいけれども、それでも残存活性について精度高い測定が可能であった。すなわち、C末固定化Sbtlについて6M GdnHClによるunfolding/2M K-acetateによるrefoldingをくり返すと3サイクル以上のくり返しでreversibleにほぼ100%refoldするC末固定Sbtlを得ることができた。
本研究の目的である(1)、(2)、(3)という3手段の優劣試験はSbtlがproteaseであるために固定化Sbtlを用いて試験する結果となった。手段(1)のrefolding mediaとして2M K-acetateを用いた方が2M KClなどを用いた時よりrefolding速度が大きいことを前提におくと、手段(2)のN末固定の方が手段(3)のC末固定の場合よりrefolding速度が大きいことがわかった。

研究成果

• [文献書誌] M.Matsubara,D.Nohara,T.Sakai: "Difference Between Guanidinium Chloride and Urea as Denaturants of Globular Proteins:The Possibility of Application to Improved Refolding Processes" Chemical & Pharmaceutical Bulletin. 40. 550-552 (1992)
• [文献書誌] M.Matsubara,D.Nohara,E.Kurimoto,Y.Kuroda,T.Sakai: "“Loose Folding"and“Delayed Oxidation"Procedures Successfully Applied for Refolding of Fully Reduced Hen Egg-White Lysozyme" Chemical & Pharmaceutical Bulletin. 41. 1207-1210 (1993)
• [文献書誌] M.Matsubara,E.Kurimoto,S.Kojima,K.Miura,T.Sakai: "Quantitative in vitro Renaturation of Subtilisin BPN' without the Aid of Pro-seguence" CHEMISTRY LETTERS. 1783-1786 (1993)
• [文献書誌] T.Hayashi,M.Mathubara,E,Kurimoto,K.Nohara,T.Sakai: "Refolding of Subtilisin BPN' Achieved Almost Quantitatively by Covalent Immobilization on an Agarose Gel" Chemical & Pharmaceutical Bulletin. 41. 2063-2065 (1993)
• [文献書誌] M.Mathubara,E.Kurimoto,S.Kojima,K.Miura,T.Sakai: "Achievement of in vitro Renaturation of Subtilisin BPN' by a Novel Procedure Using Organic Salts and a Digestible Mutant of Streptomyces Subtilisin Inhibitor" FEBS Letters. (in press). (1994)