新しい甘味蛋白質(クルクリン及びマビンリン)の大量精製法の確立と活性部位の解明

1991 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 03556009
• 研究機関: 横浜国立大学
• 研究代表者: 栗原 良枝 横浜国立大学, 教育学部, 教授 (90017715)
• 研究分担者: 栗原 堅三 北海道大学, 薬学部, 教授 (00016114) ; 山下 治之 旭電化工業(株), 研究員 ; 大谷 裕之 横浜国立大学, 教育学部, 助手 (30213763) ; 中谷 一泰 昭和大学, 薬学部, 教授 (40053855)
• キーワード: クルクリン / アビンリン / 甘味蛋白質 / 甘味誘導蛋白質

研究概要

1.マビンリンの精製法を確立した。中国雲南地方で採取した種子をn-ヘキサンで脱脂したのち、0.5M食塩水で抽出した。抽出液を硫安で塩析したのち、CM-セファロ-スカラムを用いて分画した。各画分をゲルろ過でさらに精製した結果、5種類のマビンリン同族体(I,II-1,II-2,III,IV)を単離することに成功した。これらはいずれも逆相高速液体クロマトグラフィ-により、純品であることが確認された。
2.先に開発したクルクリンの抽出法を改良し、簡便な精製法を確立した。以前は抽出の際にホモジナイザ-を用いていたが、発泡するなど欠点があった。今回、超音波発生器を用いるとより効率よく、且つ簡単に抽出されることがわかった。また、金属アフィニティ-クロマトグラフィ-により、食塩水抽出液から1段階で精製する方法を確立した。
3.マビンリンIはA鎖・B鎖の2本のポリペプチドから構成されており、アミノ酸配列順序を決定した結果、A鎖は33個のアミノ酸残基から、B鎖は72個のアミノ酸残基から構成されていることが明かになった。さらに、両鎖には8個のシステイン残基が存在し、これらはすべてジスフィド結合していることが確認された。
4.マビンリンIは耐熱性をもち、中性溶液で100℃、48時間加熱しても活性が失われない。
5.クルクリンのcDNAクロ-ニングを行った。その結果、クルクリンはN末端とC末端に22のアミノ酸残基を有するプレプロ体のプロッセシングによって成熟体になることが示唆された。

研究成果

• [文献書誌] Abe,K.,et al.: "Molecular cloning of curculin,a novel taste-modifying protein with sweet taste," Biochim.Biophys.Acta,in press.(1992)
• [文献書誌] Nakajo,S.,et al.: "An enzyme immunoassay and immunoblot analysis for curculin,a new type of taste-modifying protein: Cross-reactivity of curculin and miraculin to both antibodies," Biochim.Biophys.Acta,. 1118. 293-297 (1992)
• [文献書誌] 栗原 良枝: "甘味タンパク質および甘味誘導タンパク質." 生化学. 63. 1340-1344 (1991)
• [文献書誌] Igeta,H.,et al.: "Determination of disulphide array and subunit structure of taste-modifying protein,miraculin," Biochim.Biophys.Acta,. 1079. 303-307 (1991)
• [文献書誌] Yamashita,H.,et al.: "Purification and complete amino acid sequence of a new type of sweet protein with taste-modifying activity,curculin," J.Biol.Chem.,. 265. 15770-15775 (1990)
• [文献書誌] Y.Kurihara: "Characteristics of proteins with sweet and/or taste-modifying protein," Critical Reviews in Food Sciences and Nutrition (CRC Press),. (1992)