新しい甘味蛋白質(クルクリン及びマビンリン)の大量精製法の確立と活性部位の解明

1992 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 03556009
• 研究機関: 横浜国立大学
• 研究代表者: 栗原 良枝 横浜国立大学, 教育学部, 教授 (90017715)
• 研究分担者: 赤羽 丈明 旭電化工業(株), 開発研究所, 研究員 ; 大谷 裕之 横浜国立大学, 教育学部, 助手 (30213763) ; 栗原 堅三 北海道大学, 薬学部, 教授 (00016114) ; 中谷 一泰 昭和大学, 薬学部, 教授 (40053855)
• キーワード: 甘味タンパク質 / アビンリン / クルクリン / 耐熱性タンパク質

研究概要

1.昨年度開発したクルクリンの抽出法を改良した。すなわち、食塩水での抽出は、あらかじめ水で洗浄し、不純物を除去した後に行っていたが、水による洗浄は十分でない上に、C.latifoliaの実が褐変するという欠点があった。このことを解決するために種々検討した結果、酸性条件下(pH1.8〜4.0)で洗浄すると不純物が選択的に除去され、褐変もせず、以下の抽出がスムースに行われることがわかり、より簡便な精製法を確立することができた。さらに、以前は抽出の際にホモジナイザーを用いていたが、発泡するなど欠点があった。今回、超音波発生器を用いるとより効率よく、抽出されることがわかった。
2.マビンリンの精製法を確立した。中国雲南地方で採取した種子をn-ヘキサンで脱脂したのち、0.5M食塩水で抽出した。抽出液を硫安で塩析したのち、CM-セファロースカラムを用いて分画した。各画分をゲルろ過でさらに精製した結果、5種類のマビンリン同族体(I-1,I-2、II,III,IV)を単離した。
3.マビンリンIIはA鎖・B鎖の2本のポリペプチドから構成されており、A鎖は33個、B鎖は72個のアミノ酸残基からそれぞれ構成されている。また、システイン残基はA鎖には2個、B鎖には6個存在している。本年度はこれらのジスルフィド結合位置をすべて決定した。
4.クルクリンのcDNAの大腸菌での発現を行った。この結果、クルクリン抗体と交差反応を示すタンパク質が発現していることが確認された。しかしながら、甘味誘導活性は認められなかった。

研究成果

• [文献書誌] Liu X et al.: "Purification,complete amino acid sequence and structural characterization of the heat-stable sweet protein,mabinlin II" Eur.J.Biochem.211. 281-287 (1993)
• [文献書誌] Abe,K.et al.: "Molecular cloning of curculin,a novel taste-modifying protein with a sweet taste." Biochim.Biophys.Acta.1130. 232-234 (1992)
• [文献書誌] Kurihara,Y.: "Characteristics of antisweet substances,sweet proteins and sweet-inducing proteins" Critical Reviews in Food Science and Nutrition.32. 231-252 (1992)
• [文献書誌] Nakajo,S.et al: "An enzyme immunoassay and immunoblot analysis for curculin,a new type of taste-modifying protein:Cross-reactivity of curculin and miraculin to both antibodies." Biochim.Biophys.Acta.1118. 293-297 (1992)
• [文献書誌] Kurihara,Y.: "Structures and functions of taste modifiers and sweet proteins." ¨Natural Resources and Human-Health¨edited by S.Baba Elsevier.147-156 (1992)
• [文献書誌] Igeta,H.et al: "Determination of disulfide array and subunit structure of taste-modifying protein,miraculin." Biochim.Biophys.Acta.1079. 303-307 (1991)