非放射性標識オリゴDNAプロ-ブの自動合成システム開発

1991 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 03557001
• 研究機関: 滋賀医科大学
• 研究代表者: 木村 宏 滋賀医科大学, 分子神経生物学研究センター, 教授 (40079736)
• 研究分担者: 神谷 鉄也 東亜合成化学工業, 研究員 ; 吉田 祇生 東亜合成化学工業, 主任研究員 ; 大杉 義彰 島津製作所, 技術課主任 ; 秋山 純一 島津製作所, 副部長 ; 遠山 育夫 滋賀医科大学, 分子神経生物学研究センター, 助手 (20207533)
• キーワード: ビオチン / cDNA / プロ-ブ / 核酸 / in situハイブリダイゼ-ション / 自動合成機

研究概要

DNA合成装置(アプライド・バイオシステム社、モデル391を購入し、世界的に広く使用されている合成法を本試験研究でのシステム開発に応用できるように試みた。本研究センタ-で確立しているin situハイブリダイゼ-ションの信頼できるプロ-ブとして、バゾプレッシンcDNAのうち30merのオリゴヌクレオチドを合成し検討材料とした。非放射性標識物質としてビオチンをとりあげた。ビオチンをcDNAに組み入れる原理として、(1)ブロモデオキシウリジンをcDNAに組み込み合成し、その後でビオチン化ブロモデオキシウリジン抗体を用いる方法、(2)フォトアフィニティ-標識法によるビオチン化プロ-ブの作成、(3)ビオチン化ATPまたはビオチン化UTPを用いてプロ-ブをPCR法により標識する手技、(4)3'末端に活性化第一級アミンを結合する方法、(5)6炭素鎖末端にアミンを導入したAH-ビオチン結合法、などを考案または検討した。(1)と(2)は自動化システムとしては実用化には不適であり、(3)はノ-ザンブロッティングなど化学的研究法にに適するプロ-ブが容易に作製でき、さらに(4)と(5)はin situハイブリダイゼ-ションに最適のプロ-ブが作成可能であるという実験結果を得た。とくに(5)の方法では、市販のビオチンONという試薬を用いて、3'末端のみならず5'末端あるいはプロ-ブ配列中の任意の核酸と置換できることが判明した。したがって、当初の目的は基礎的に既に達成させたといえる。今後の目標は、in situハイブリダイゼ-ションという目的に絞って、実用的なビオチン導入量比の決定を行い、次いでバゾプレッシン以外のプロ-ブについて応用範囲の広い安定した反応条件を確立することにある。この目標が達成された時点で、本試験研究は実用化への実現をみることができ、次年度中に完結できる見込みが極めて大きい。

研究成果

• [文献書誌] Yamada,T.,Kimura,H.: "Regional effects of ceruletide, a cholecystokinin-8 analog,on the striatal monoaminergic systems in food-deprived mice." Brain Res.540. 25-30 (1991)
• [文献書誌] Tooyama,I.,Akiyama,H.,McGeer,P.L.,Hara,Y.,Yasuhara,O.,Kimura,H.: "Acidic fibroblast growth factor-like immunoreactivity in brain of Alzheimer patients." Neurosci.Lett.121. 155-158 (1991)
• [文献書誌] Ding,W.G.,Fujimura,M.,Tooyama,I.,Kimura,H.: "Phylogenetic study of serotonin-immunoreactive structures in the pancreas of various vertebrates." Cell Tiss.Res.263. 237-243 (1991)
• [文献書誌] Tooyama,I.,Hara,Y.,Yasuhara,O.,Oomura,Y.,Sasaki,K.,Muto,T.,Suzuki,K.,Hanai,K.,Kimura,H.: "Production of antisera to acidic fibroblast growth factor and their application to immunohistochemical study in rat brain." Neuroscience.40. 769-779 (1991)
• [文献書誌] Yamada,T.,Hirayama,K.,Kimura,H.: "Differential responses of noradrenaline and dopamine neurons in the mouse forebrain induced by continuous parenteral infusion of haloperidol." Eur.Neurol.31. 28-33 (1991)
• [文献書誌] Fujimiya,M.,Maeda,T.,Kimura,H.: "Serotonin-containing epithelial cells in rat duodenum I.Quantitative morphametric study of the distribution density." Histochemistry.95. 213-224 (1991)
• [文献書誌] Fujimiya,M.,Maeda,T.,Kimura,H.: "Serotonin-containing epithelial cells in rat duodenum II. Quantitative study of the effect of 5HTP administration." Histochemistry.95. 225-229 (1991)
• [文献書誌] Araki,M.,Kimura,H.: "GABA-like immunoreactivity in the developing chick retina: differentiation of GABAergic horizontal cell and its possible contacts with photoreceptors." J.Neurocytol.20. 345-355 (1991)
• [文献書誌] Uehara-Kunugi,Y.,Terai,K.,Taniguchi,T.,Tooyama,I.,Kimura,H.: "Time course of in vitro expression of NADPH-diahorase in cultured rat brain neurons: comparison with in vivo expression." Devel.Brain Res.59. 157-162 (1991)
• [文献書誌] Uemura,S.,Ienaga,K.,Higashiura,K.,Kimura,H.: "Effects of intraamygdaloid injection of taurine and valyltaurine on amygdaloid kindled seizure in rats." Jpn.J.Psychiatr.Neurol.45. 383-385 (1991)
• [文献書誌] Nakamura,S.,Kawamata,T.,Yasuhara,O.,Akiguchi,I.,Kimura,J.,Kimura,H.: "The histochemical demonstration of monoamine oxiase-containing neurons in the human hypothalamus." Neuroscience.44. 457-463 (1991)
• [文献書誌] Yasuhara,O.,Tooyama,I.,Akiyama,H.,Akiguchi,I.,Kimura,J.,McGeer,P.L.,Hara,Y.,Kiumura,H.: "Reactive astrocytes express acidic fibroblast growth factor in Alzheimer's disease brain." Dementia.2. 64-70 (1991)
• [文献書誌] Fujimiya,M.,Kimura,H.: "Effect of lateral hypothalamic area lesions on serotonin-containing epithelial cells in rat duodenum." Brain Res.Bull.27. 521-528 (1991)
• [文献書誌] Ding,W.G.,Fujimura,M.,Mori,A.,Tooyama,I.,Kimura,H.: "Light and electron microscopy of neuropeptide Y-containing nerves in human liver,gallbladder,and pancreas." Gastroenterology.101. 1054-1059 (1991)
• [文献書誌] Aimi,Y.,Fujimura,M.,Vincent,S.R.,Kimura,H.: "Localization of NADPH-diaphorase-containing neurons in sensory ganglia of the rat." J.Comparative Neurology.306. 382-392 (1991)
• [文献書誌] Maeda,T.,Kojima,R.,Arai,R.,Fujimiya,M.,Kimura,H.,Kitahama,K.,Geffard,M.: "Monoaminergic interaction in the central nervous system:a morphological analysis in the locus coeruleus of the rat." Comp.Biochem.Physiol.C.98. 193-202 (1991)
• [文献書誌] Nakayasu,H.,Mizutani,H.,Hanai,K.,Kimura,H.,Kuriyama,K.: "Monoclonal antibody to GABA binding protein, a possible GABAв receptor" Biochem.Biophys.Res.Comm.182. 722-726 (1992)
• [文献書誌] Tanaka,H.,Mori,S.,Kimura,H.: "Developmental changes in the serotoninergic innervation of hindlimb extensor motoneurons in neonatal rats." Devel.Brain Res.65. 1-12 (1992)
• [文献書誌] Vincent,S.R.,Kimura,H.: "Histochemical mapping of nitric oxide synthase in the rat brain." Neuroscience.46. 755-784 (1992)