| 研究概要 |
本研究の目的は、非NMDA型グルタミン酸受容体cDNA(GluR1-GluR3)を単独または種々の組合わせで、グルタミン酸受容体をもたない哺乳動物の培養細胞のクロモゾ-ムに組み込み、グルタミン酸受容体を発現する培養細胞株を樹立することである。まずラット脳のグルタミン酸受容体cDNAのうち、GluR1,GluR2,GluR3をS.Heinemann博士(ソ-ク研究所)から譲り受けた。本年度はこのうち、GluR1とGluR3cDNAをそれぞれ単独に、動物発現プロモ-タsRα(SV40とRSVプロモ-タを組合せて強力にしたもの)下に組み込んだ。これらの組換え体DNAをリン酸カルシウムゲル共役沈殿法によりC6細胞(ラット神経膠腫由来の培養細胞株)に導入した。これらの細胞をネオマイシンでスクリ-ニングし、ネオマイシン耐性の細胞群を得た。これらの細胞を対象としてパッチクランプ法により、非NMDA型受容体のアゴニストであるカイニン酸、AMPA、グルタミン酸を投与して応答を調べたが、有意の膜電流応答を得ることができなかった。またGluR1とGluR3を単独で発現した細胞では、これらの受容体チャネルが高いCa^<2+>透過性をもつので、非NMDA型受容体アゴニストの刺激により細胞内Ca^<2+>濃度の上昇することが期待される。そこでfura-2蛍光法を用いてネオマイシン耐性能を獲得したC6細胞にカイニン酸を投与して細胞内Ca^<2+>濃度の変化を調べたが有意な反応を得ることができなかった。従って、現時点では哺乳動物培養細胞株での非NMDA型受容体cDNAの機能的発現に成功していない。今後、GluR1-GluR3のmRNAの発現、標識アゴニスト([ ^3H]AMPAなど)の結合実験を行い、C6細胞で機能的チャネルの発現しない理由を検討するとともに、C6細胞以外の種々の培養細胞株を対象として今年度と同様の実験を行い、本研究の目的に適合する細胞種を検索する予定である。
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