単一遊離平滑筋細胞のミオシンの機能とリン酸化を解析する為のミクロ技術開発

1991 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 03557010
• 研究機関: 群馬大学
• 研究代表者: 小浜 一弘 群馬大学, 医学部, 教授 (30101116)
• 研究分担者: 八木 忍 自治医科大学, 講師 (10111296) ; 大室 弘美 東京大学, 医学部, 助手 (00124470) ; 石川 良樹 群馬大学, 医学部, 助手 (20212863)
• キーワード: 平滑筋 / アクトミオシン / ミオシン / リン酸化 / 単一細胞 / アクチン

研究概要

近年になり平滑筋の薬物反応を細胞レベルで観察する研究が進み、細胞間に不均一性のある事が明らかになってきた。薬物反応の重要な指標である収縮もこの例外ではなく、収縮を担っているアクトミオシン系についても遊離された、しかも単一細胞について検討する必要性が生じている。然るにアクトミオシン系の研究では微量化・高感度化の試みが著しく遅れているのが現状であり、本研究が開始された。
1)ピロリン酸電気泳動の微量化について、モルモット結腸紐条片をK-拘縮時の各時間に於いてドライアイス・アセトンにより急速凍結した。凍結試料を予め液体N2で冷却したステンレス製のMillに移し、破壊された試料をEGTAとピロリン酸を含む試料液に移した。不溶物を遠心に除去し、ピロリン酸電気泳動にかけたところ、収縮に伴うミオシンのリン酸化バンドを検出することができた。この実験は内径0.5mmのガラス管を用いても同様な泳動が行えた。これにより約1,000倍の微量化が可能となった。
2)ミオシン検出感度について:1)に示した実験は、コマジ-・ブリリアントブル-により染色したが、銀染色法を用い100倍程度増感できた。最近、銀染色法以上の高感度な染色法の開発が行われているため(フェリダイ、オ-ロダイなど)、染色法についてはさらに感度を上げることが可能であった。
3)In Vitro Motility Assay法について:従来、ガラス面に固定するのは精選されたミオシンであったが、ラベルされたアクチン線維はミオシン上をすべり運動を行ったところ、本研究でテストする粗製ミオシンでも十分であった。

研究成果

• [文献書誌] Kohama,K.,Hiranuma,T.,Takano-Ohmuro,H.,Ozaki,H.,Karaki,H.and Hachisu,M.: "Effects of NAO344、a new smooth muscle relaxant,on the actin-myosin-ATP interaction and myosin light chain phosphorylation in vitro." General Pharmacology. 22. 465-474 (1991)
• [文献書誌] Hayakawa,K.,Okagaki,T.,Dobashi,T.,Sakanishi,A.,Kaneko,K.and Kohama,K.: "Okadaic acid stimulates the ATP-dependent interaction between actin and myosin of smooth muscle via a direct effect on myosin." Biochemical Biophysical Research Communication. 117. 1155-1160 (1991)
• [文献書誌] Kaneko,K.,Takano-Ohmuro,H.,Iwai,T.and Kohama,K.: "A protein-bound polysaccharide from Basidiomycetes enhances myosin phosphorylation but inhibits myosin ATPase activity:Studies with a crude actomyosin preparation of chicken gizzard smooth muscle." Journal of Biochemistry. 110. 851-853 (1991)
• [文献書誌] Oishi,K.,Takano-Ohmuro,H.,Minakawa-Matsuo,N.,Suga,O.,Karibe,H.,Kohama,K.and Uchida,M.K.: "Oxytocin contracts rat uterine smooth muscle in Ca^<2+>-free medium without any phosphorylation of myosin light chain." Biochemical Biophysical Research Communication. 176. 122-128 (1991)