単一遊離平滑筋細胞のミオシンの機能を解析する為のミクロ技術関発

1992 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 03557010
• 研究機関: 群馬大学
• 研究代表者: 小浜 一弘 群馬大学, 医学部, 教授 (30101116)
• 研究分担者: 八木 忍 自治医科大学, 講師 (10111296) ; 大室 弘美 東京大学, 医学部, 助手 (00124470) ; 石川 良樹 群馬大学, 医学部, 助手 (20212863)
• キーワード: 平滑筋 / アクトミオシン / ミオシン / リン酸化 / 単一細胞 / アクチン

研究概要

近年になり平滑筋の薬物反応を細胞レベルで観察する研究が進み、細胞間に不均一性のある事が明らかになってきた。薬物反応の重要な指標である収縮もこの例外ではなく、収縮を担っているアクトミオシン系についても遊離された、しかも単一細胞について検討する必要性が生じている。然るにアクトミオシン系の研究では微量化・高感度化の試みが著しく遅れているのが現況であり、本研究が開始された。
本研究では、すでに確立している薬物反応性のある遊離平滑筋細胞作成法を利用することよりスタートする。研究代表者らはアクチン・ミオシンの相互作用およびミオシン・リン酸化検出法につき微量化・高感度化の図れそうな次のテクニックに注目した。これらは
1)収縮中の平滑筋組識を急速凍結し、リン酸化状態を変化させないまま粗製アクトミオシンを抽出する方法、
2)ピロリン酸を電極液とする末変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により粗製アクトミオシン中のミオシンのリン酸化レベルを検出する方法、
3)アクチン・ミオシン間のすべり運動を微量で顕微鏡下で検出するIn Vitro Motility Assay 法である。
1)に関しては、ドライアイス・アセトンで急速に冷却・固定し、液体N_2下で破壊し、ピロリン酸下で抽出すること;2)に関しては、内径0.1mmのキャピラリ下で泳動を行い微量化を図ること;3)に関しては、フォスファターゼ阻害薬とキナーゼ阻害薬の利用が有効であることが判明した。

研究成果

• [文献書誌] Ishikawa,R.,Kagami,C.,Hayashi,C.and Kohama,K.: "The binding of nonmuscle caldesmon from brain to microtubules.Refulation by Ca^<2+> -caldesmon and cdc 2 Kinase." FEBS Lett.229. 54-56 (1992)
• [文献書誌] Kohama,K.,Okagaki,T.,Hayakawa,K.,Lin,Y,Ishikawa,R.,Shimmen,T.and Inoue,A.: "A novel regulatory effect of myosin light chain kinase from smooth muscle on the ATP-dependent interaction between actin and myosin." Biochem.Biophys.Res.Commun.184. 1204-1221 (1992)
• [文献書誌] Lin,Y.,Ishikawa,R.and Kohama,K.: "A novel regulatory protein that affects the function of caldesmon and myosin light chain kinase." Biochem.Biophys.Res.Commun.184. 1212-1218 (1992)
• [文献書誌] Ishikawa,R.,Okagaki,T.and Kohama,K.: "Regulation by Ca^<2+>-calmodulin of the action-bundling activity of physarum 210-KDa protein." J.Muscle Res.Cell Motil.13. 321-328 (1992)
• [文献書誌] Kohno,T.,Ishikawa,R.,Nagata,T.,Kohama,K.and Shimmen,T.: "Partial purification of myosin from lily pollen tubes by monitoring with in vitro motility assay." Protoplasma. 170. 77-85 (1992)
• [文献書誌] Ishikawa,R.,Kagami,O.,Hayashi,C.and Kohama,K.: "Characterization of smooth muscle caldesmon as a microtubule-associated protein." Cell Motil.Cytoskel.23. 244-251 (1992)
• [文献書誌] Kazuhiro Kohama: "Calcium Inhibition" Japan Sci.Soc.Press,and CRC Press., 205 (1992)
• [文献書誌] Kazuhiro Kohama,Ryoki Ishikawa,and Tsuyoshi Okagaki: "Calcium Inhibition of physarum Actomyosin System:Myoshi-linked and Actin-linked Natures.In Calcium Knhibition p.p.91〓〓07." Japan Sci.Soc.Press,and CRC Press.K.Kohama,ed., 16 (1992)