| 研究課題/領域番号 |
03557013
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| 研究機関 | 山口大学 |
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研究代表者 |
中澤 淳 山口大学, 医学部, 教授 (90025594)
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| 研究分担者 |
熊原 尋美 宇部興産株式会社, 宇部研究所, 課長
野間 隆文 山口大学, 医学部, 講師 (40189428)
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| キーワード | プロモーター / ベペクター / 培養細胞 / カテコール / C230 |
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| 研究概要 |
アデニル酸キナーゼアイソザイム1(AK1)は動物の骨格筋において多量に合成されている。我々は既に鶏骨格筋のAK1 cDNAをクローン化しているので、AK1のN末端2アミノ酸を含むDNA断片を取り出し、メタピロカテカーゼ遺伝子の5側をBal31ヌクレアーゼで欠失させたDNA断片につなぎ、融合遺伝子プラスミドPKSAD2を作製した。このプラスミドで形質転換したJM109から抽出液を調製してメタピロカテカーゼ活性を測定したところ極めて高い活性値がえられた。このことから、メタピロカテカーゼの合成がAK1蛋白の合成指令配列の支配下にあることがわかる。ここでえたAK1-C230融合遺伝子をSV40のプロモーター/エンハンサー、ベクターに導入し、PSVAD2を作製した。
同様にして、ヒト伸長因子遺伝子プロモーター/エンハンサー、ベクターpEF-321neoのneo遺伝子とC230遺伝子を置換し、さらにこれにSU40のpalyA領域を挿入してPEFKS230を作った。
上に得たプラスミドをHela細胞とCHO細胞にリン酸カルシウム法により導入し、30時間培養した後、抽出液を凍結融解法により調製し、メタピロカテカーゼ活性を測定したが活性は検出できなかった。抽出液を音波破砕法で調製してもやはり活性が検出されなかった。抽出液をSDS電気泳動にかけWesternブロット法によりメタピロカテカーゼに対する抗体と反応させた後ECL(Amersham)により染色し免疫反応物を検索したが陽性のバンドはえられなかった。
ここで用いたプロモーター/エンハンサープラスミドは、SV40のものでもヒト伸長因子のものでも光分転写活性をもっていることを確認しているので、発現がみられなかったのはC230遺伝子の翻訳以後の段階に問題があったのであろう。
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