アラキドン酸カスケ-ド酵素のスクリ-ニング用キットの遺伝子工学による開発

1991 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 03557014
• 研究機関: 徳島大学
• 研究代表者: 山本 尚三 徳島大学, 医学部, 教授 (50025607)
• 研究分担者: 吉本 谷博 徳島大学, 医学部, 助教授 (60127876) ; 松本 隆志 日本たばこ産業株式会社, 生命科学研究所, 主席研究員 ; 田辺 忠 国立循環器病センター, 薬理部, 部長 (60025624) ; 清水 孝雄 東京大学, 医学部, 教授 (80127092)
• キーワード: Arachidonic acid / Cyclooxygenase / Thromboxane A_2 Synthase / 12-Lipoxygenase / 5-Lipoxygenase / Leukotriene A_4 hydrolase / Leukotriene C_4 synthase / cDNA

研究概要

本年度は次の計画研究を実施した。
1.酵素のcDNAクロ-ニング
ヒトの血小板のシクロオキシゲナ-ゼのcDNA(山本)、ならびにヒト血小板のトロンボキサン合成酵素のcDNA(田辺)を、PCR法によりクロ-ニングし、また、ヒトのシクロオキシゲナ-ゼの遺伝子断片をプロ-ブとして、ヒト血管内皮細胞cDNAのλgt11ライブラリ-から全長を含むと考えられるクロ-ンを得て、現在その塩基配列を決定中である(田辺)。ロイコトリエンC_4合成酵素cDNAのクロ-ニングも同時に進めている(清水)。
2.クロ-ン化酵素の大量調製
ブタ白血球のアラキドン酸12-リポキシゲナ-ゼのcDNAを大腸菌の系で発現させるために、cDNAをtacプロモ-タをもつpKKプラスミドに組み込み、発現ベクタ-を構築した。この発現ベクタ-で形質転換した大腸菌の抽出物が12-リポキシゲナ-ゼ活性をもつことが示された。現在、酵素の大量調製のために、大腸菌の培養条件や酵素の大量精製方法などについて検討を行なっている(吉本)。また5-リポキシゲナ-ゼcDNAを大腸菌ならびに酵母で発現して、酵素を大量に生産する条件を検討している(松本)。ロイコトリエンA4水解酵素については、既に開発している大量発現系、免疫抗体による酵素量の測定系などの一層の改良を進めるとともに、本酵素の持つアミノペプチダ-ゼ活性に注目し、不安定な基質を用いずにアミノペプチダ-ゼ活性で特異的に本酵素を測定する方法の開発に着手している(清水)。
2.酵素の特異的領域に対する抗体の作成
ヒトシクロオキシゲナ-ゼのアミノ酸配列に相当する15〜40残基のペプチドを合成し、ヘモシアニンに結合させ、ペプチドに対する特異的な抗体を作成中である(田辺)。

研究成果

• [文献書誌] Hada,T.: "Catalytic properties of human platelet 12-lipoxygenase as compared with the enzymes of other origins" Biochim.Biophys.Acta. 1083. 89-93 (1991)
• [文献書誌] Honda,Z.: "Cloning by functional expression of platelet-activating factor receptor from guinea-pig lung" Nature. 349. 342-346 (1991)
• [文献書誌] Matsuda,S.: "Analysis of non-heme iron in arachidonate 12-lipoxygenase of porcine leukocytes" Biochim.Biophys.Acta. 1084. 202-204 (1991)
• [文献書誌] Natsui,K.: "Arachidonate 5-lipoxygenase of porcine pancreas:its localization in acinar cells" Biochim.Biophys.Acta. 1084. 241-247 (1991)
• [文献書誌] Oshima,T.: "cAMP-dependent induction of fatty acid cyclooxygenase mRNA in mouse osteoblastic cells(MC3T3-E1)" J.Biol.Chem.266. 13621-13626 (1991)
• [文献書誌] Yokoyama,C.: "Molecular cloning of human platelet thromboxane A synthase" Biochem.Biophys.Res.Commun.178. 1479-1484 (1991)
• [文献書誌] Yamamoto,S.: "Recent Advances in Thrombosis and Fibrinolysis" Academic Press, 145-156 (1991)
• [文献書誌] Yoshimoto,T.: "Lipoxygenase and Their Products" Academic Press, 89-104 (1991)