アラキドン酸カスケード酵素のスクリーニング用キットの遺伝子工学による開発

1992 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 03557014
• 研究機関: 徳島大学
• 研究代表者: 山本 尚三 徳島大学, 医学部, 教授 (50025607)
• 研究分担者: 吉本 谷博 徳島大学, 医学部, 助教授 (60127876) ; 松本 隆志 日本たばこ産業株式, 生命科学研究所, 主席研究員 ; 田辺 忠 国立循環器病センター研究所, 部長 (60025624) ; 清水 孝雄 東京大学, 医学部, 教授 (80127092)
• キーワード: アラキドン酸 / シクロオキシゲナーゼ / トロンボキサンA合成酵素 / 12-リポキシゲナーゼ / 5-リポキシゲナーゼ / ロイコトリエンA水解酵素 / ロイコトリエンC合成酵素 / アラキドン酸カスケード

研究概要

平成3年度の終りまでに、ヒト・ヒツジのシクロオキシゲナーゼ、ヒトの5-リポキシゲナーゼ、ヒト・ブタの12-リポキシゲナーゼ、ヒトのトロンボキサンA合成酵素、ヒトのロイコトリエンA水解酵素のcDNAのクローニングを終り、それを大腸菌や動物細胞に発現させることにも成功していた。平成4年度にはその実績の上に、次のような成果を得た。
1)酵素免疫測定法の開発:ヒト血小板12-リポキシゲナーゼに対するモノクローン抗体を利用して、サンドウィッチ方式のペルオキシダーゼ共役の酵素免疫測定法を開発し、ヒト血小板可溶性画分の12-リポキシゲナーゼ蛋白量を測定できるようになった。この方法を適用して、12-リポキシゲナーゼ低下症を伴う白血病患者の血小板を検討した(吉本)。また、ロイコトリエンA水解酵素cDNAを大腸菌で高発現することができたので、この酵素の簡易免疫測定法を開発した(清水)。さらに、ヒトのシクロオキシゲナーゼcDNAクローニングによって、その一次構造が解明された結果、酵素の特定の部位のペプチドに対する抗体を作ることを試み、シクロオキシゲナーゼの460-475残基を認識する抗体を得た(田辺)。
2)酵素mRNA定量法の開発:各酵素のcDNAをプローブとするノーザンプロット法で、定性的に酵素のmRNAを追跡できるようになっているが、ヒト血小板12-リポキシゲナーゼを逆転写PCR法で増幅して、同時に増幅された内部標準cRNAを基準として12-リポキシゲナーゼmRNAを定量化する方法を開発し、上記の白血病患者の血小板の12-リポキシゲナーゼmRNA量が低下していることを明らかにした(山本)。
このようにcDNAとリコンビナント酵素の遺伝子工学的調製の目途が立ち、それぞれキット化する試みを進めている。

研究成果

• [文献書誌] Y.Takahashi: "Immunoaffinity purification and cDNA cloning of human platelet prostaglandin endoperoxide synthase(cyclooxygenase)" Biochem.Biophys.Res.Commun.182. 433-438 (1992)
• [文献書誌] T.Arakawa: "Molecular structure and function of the porcine arachidonate 12-lipoxygenase gene" J.Biol.Chem.267. 12188-12191 (1992)
• [文献書誌] S.Yamamoto: "Mammalian lipoxygenases:molecular structures and functions" Biochim.Biophys.Acta. 1128. 117-131 (1992)
• [文献書誌] T.Yoshimoto: "Structure and chromosomal localization of human arachidonate 12-lipoxygenase gene" J.Biol.chem.267. 24805-24809 (1992)
• [文献書誌] M.Minami: "Leukotriene A_4 hydrolase,a bifunctional enzyme:distinction of leukotriene A_4 hydrolase and aminoprptidase activities by site-directed mutagenesis at Glu-297" FEBS Lett.309. 353-357 (1992)
• [文献書誌] H.Ihara: "Induction of thromboxane synthase and prostaglandin endoperoxide synthase mRNAs in human erythroleukemia cells by phorbol ester" FEBS Lett.306. 1479-1484 (1992)
• [文献書誌] Y.Takahashi: "Proceedings of the 1st International Congress on Vitamins and Biofactors in Life Science" Center for Academic Publications Japan, 134-137 (1992)
• [文献書誌] Z.Honda: "Hormonal Control of Defence and Immunity" IRL Press, (1992)