寄生原虫の特有な酵素遺伝子を標的としたPCRを用いる熱帯熱マラリアのDNA診断法

1991 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 03557020
• 研究機関: 岡山大学
• 研究代表者: 綿矢 有佑 岡山大学, 薬学部, 助教授 (90127598)
• 研究分担者: 山根 明男 湧永製薬(KK), バイオ研究所, 主任研究員 ; 太田 伸生 岡山大学, 医学部, 助教授 (10143611) ; 根岸 和雄 岡山大学, 遺伝子実験施設, 助教授 (70116490) ; 早津 彦哉 岡山大学, 薬学部, 教授 (10012593) ; 石井 明 国立予防衛生研究所, 寄生虫部, 部長 (40012752)
• キーワード: マラリア / DNA診断 / PCR / 三日熱マラリア / 熱帯熱マラリア / ソロモン諸島国 / ガダルカナル島

研究概要

本研究は熱帯熱マラリアを迅速且つ簡便に診断するDNA診断法の構築を行い、マラリア樸減に寄与する事を目的としている。本年度は、マラリア原虫特有なDNA配列をPolymerase Chain Reaction(PCR)を用いて増幅して検出する三方式を開発し、マラリア流行地であるソロモン諸島国ガタルカナル島で試行し評価したところ顕微鏡法より感度及び精度共に優れている事が判った。以下、我々が開発した三方法について概要を記す。(1)Dowble PCR法:熱帯熱マラリアの特有な酵素であるシヒドロ葉酸還元酵素-チミジル配合成酵素のjunction部位の410bpを増幅したのち、さらに増幅産物内部の226bpを増幅し、アガロ-ス電気泳動後、ゲルをエチジマ-ムブロマイド染色して、増幅産物の有無を調べる。226bpのバンドが検出されると患者血液中に熱帯熱マラリア原虫が存在することを意味し確定診断となる。検出感度は原虫10個/10ul(全血)であった。(2)マイクロタイタ-プレ-ト上で発色させる方法:ED-PCR法について;人間とマラリア原虫のリボゾ-ムDNA配列に差異がある事を利用し、ビオチン及びジニトロフェニル基で標識したプライマ-でPCRを行い、増幅産物をストレプトアビジン固相化プレ-ト上に捕足し、アルカリホスフアタ-ゼ標識抗ジニトロフエニ-ル抗体と反応させ、P-ニトロフエニルリン酸を用いて発色色(黄色)させる。マイクロプレ-トハイブリダイゼ-ション法;ゼオチン標識プライマ-を用いてPCRを行い、増幅産物を、熱帯熱及び三日熱マラリア特有のDNAを固相化したプレ-トにそれぞれ加えハイブリダイゼ-ションを行った後、アルカリホスファタ-ゼ標識ストレプトアビジンを加え、ED-PCR法と同様に発色させる。この方法を用いると三日熱マラリアと熱帯熱マラリアをそれぞれ識別判定できる。検出感度はマラリア原虫100個/10ul(全血)であった。発色法は簡便で4〜6時間で診断できた。

研究成果

• [文献書誌] Y.Wataya,F.Kubochi,C.Mizukoshi,Y.Ohya,K.Watanabe,M.Arai,A.Ishii,S.Nakagami,and A.Yamane: "DNA Diagnosis of Falciparum Malaria" Nucleic Acids Symposium Series. 25. 155-156 (1991)
• [文献書誌] 綿矢 有佑,新井 明治,山根 明男: "PCRを用いるマラリアのDNA診断" 化学療法の領域. 8. 487-496 (1992)
• [文献書誌] Y.Wataya,M.Arai,F.Kubochi,C.Mizukoshi,T.Kakatani,N.Ohya,and A.Ishii: "DNA Diagnosis of Falciparum Malaria in the Solomon Islands Using a PCR Technique" Transaction of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene.
• [文献書誌] F.Kubochi,Y.Ohya,K.Watanabe,M.Arai,A.Ishii,S.Nakagami,T.Kawazoe,A.Yamane and Y.Wataya: "DNA Diagnosis of Falciparum Malaria Using Universal Probe System" Nucleic Acids Res.