共焦点糸による培養細胞・切片内サイクリックヌクレオチド

1992 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 03557034
• 研究機関: 放送大学
• 研究代表者: 鬼頭 昭三 放送大学, 教養学部, 教授 (00010140)
• 研究分担者: 三好 理絵 東京女子医科大学, 助手 (80209965)
• キーワード: 培養神経細胞 / Cyclic AMP / A-kina se / 蛍光標識 / regulatory subunit / catalytic subunit / tetramethylrhodamin / fluorescein

研究概要

培養神経細胞を用いてcyclic AMPを蛍光測光するための基本的問題に関する実験を行った。
cyclic AMPそのものを蛍光標識することは事実上困難であり、cyclicAMP依存性蛋白リン酸化酵素(A-kinase)を測光することになる。A-kinaseはregulatory subunitとcatalytic subunitからなり、cyclicAMPが結合することにより、2つのsubunitが解離し、後者のsubunitの活性が発現することになる。regulatory subunitとcatalytic sub-unitを別々に蛍光標識した。この2つの蛍光色素により発する波長域を検討することにより、regulatory subunitとcatalytic subunitが解離しない状態にあるときはcatalytic subunitからの蛍光はregulatorysubunitの励起光になり、両分子が離れている時のみcatalytic sub-unitからの蛍光が検出されるように考案した。
cyclic AMP依存性酵素のregulatory subunitのcDANを大腸菌の中にいれ,タンパク質を得る実験を行った。この様にして得たregulatorysubunitをtetramethylrhodamineでcatalytic subunitをfluoresceinでそれぞれ標識し、これらを神経細胞内にmicroinjectionし各sub-unitを共役的に結合させると共に色素と蛋白がstoichiometry的に1対1となるように実験を行った。
この実験は試行錯誤的な面が多い。又、cyclic AMPの三次元的解析を行うために蛍光顕微に適応するフィルター系とモーター駆動フォーカスコントローラーを用いて、z軸方向の任意の点でフォーカスを合わせるようにし、共焦点的に蛍光像を捕らえ、三次元解析の為の準備を完了した。

研究成果

• [文献書誌] Miyoshi,R.,Kito,S.,Nomoto,T.,Doudou,N.: "Influence of age on N-methyl-D-aspartate antagonist binding site in the rat brain studied by in vitro autoradiography" SYNAPSE. 8/3. 212-217 (1991)
• [文献書誌] Miyoshi,R.,Kito,S.,Doudou,N.,Nomoto,T.: "Effect of age on α-amino-3-hydroxy-5 methylisoxazole-4-propionic acid (AMPA) binding sites in the rat brain studied by in vitro autoradiography" Neurochem.Res.,. 16. 848-854 (1991)
• [文献書誌] Yoneda,Y.,Ogita,K.,Emoto,R.,Suzuki,T.,Kito,S.: "Identification and characterization of specific binding site of [^3H] spermidine in synaptic membranes of rat brain" Brain Research. 563. 17-27 (1991)
• [文献書誌] Miyoshi,R.,Kito,S.,Nomoto,T.,: "Cholecystokinin increases intracellular Ca^<2+> concentration in cultured striatal neurons" Neuropeptides. 18. 115-119 (1991)
• [文献書誌] Miyoshi,R.,Kito,S.,Nomoto,T.,Weiser,M.,: "Effect of caerulein on expression of the immediate early genes c-fos and zif/268 in the rat brain" Joh,T.Neuroscience Letter. 145. 205-208 (1992)
• [文献書誌] Miyoshi,R.,Kito,S.,Tanaka,A.: "Effect of neurotensin on dopamine and muscarinic acetylcholine receptors in the rat striatum" Basal Ganglia III,27. 39. 371-378 (1992)
• [文献書誌] Kito,S.,Miyoshi,R.,Nomoto,T.: "NMDA Receptor Related Agents" NPP Books, 414 (1991)
• [文献書誌] Kito,S.,Miyoshi,R.: "Neurotransmitter Receptors :Neuroreceptor Mechanism in Brain" Plenum Press, 495 (1991)