| 研究課題/領域番号 |
03557034
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| 研究種目 |
試験研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
内科学一般
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| 研究機関 | 放送大学 |
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研究代表者 |
鬼頭 昭三 放送大学, 教養学部, 教授 (00010140)
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| 研究分担者 |
三好 理絵 東京女子医科大学, 助手 (80209965)
仙波 純一 放送大学, 教養学部, 助教授 (30183429)
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| 研究期間 (年度) |
1991 – 1993
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| キーワード | カルシウムイオン濃度 / 蛍光測光法 / cyclic AMP / cyclic AMP依存性酵素 / regulatory subunit / catalytic subunit / isothiocyanate / D1 and D2 receptors |
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| 研究概要 |
近年、fura-2その他を用いた蛍光測光法により細胞内カルシウムイオン濃度、([Ca^<2+>])の測定が培養細胞やスライスを用いて行われている。カルシウムイオンと並んで細胞内情報伝達系の担い手であるcyclic AMPおよび小脳系・視覚系その他で重要な生理的意義を持つcyclic GMPについては、組織ホモジネートを用いた生化学的測定法に依存しており、蛍光測光法による生きた細胞や組織での定量的測定は、確立されていない。本研究では、蛍光測光法によるサイクリックヌクレオチドの測定法を確立すると共に、これをモーター駆動フォーカスコントローラーを装備した蛍光顕微鏡を用いて三次元的に観察することを目的とした。
cyclic AMP依存性酵素のregulatory subunitのcDNAを大腸菌の中にいれ、タンパク質を得る実験を行った。この様にして得たregulatoly subunitをtetramethylrhodamine(isothiocyanateで、catalytic(C)subunitをfluorescein isothiocyanate)で、catalytic subunitをfluoresceinでそれぞれ標識し、これらを神経細胞内にmicroinjectionした。
regulatory subunitとcatalytic subunitが解離しない状態にあるときはcatalytic subunitからの蛍光はregulatory subunitの励起光になり、両分子が離れている時のみcatalytic subunitからの蛍光が検出されるように考案した。
線条体の培養神経細胞の中には、D_1受容体を含むものとD_2受容体を含むものがあり、D_1受容体が刺激された場合には、逆の方向になる。更にD_1受容体、D_2受容体が同一の神経細胞に存在するため、その効果が相殺しあう点もあり、毎常cyclic AMPを測定できることは手技の複雑さとあいまって、困難であることがわかった。
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